托西酸舒他西林中對甲基苯磺酸烷基酯檢查方法研究

姚蘭?傅蓉?鄒宇?孫苓苓

摘要：目的 對工藝中可能產生的對甲基苯磺酸烷基酯建立氣相色譜-三重四極桿質譜聯用的測定方法。方法 以（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱為色譜柱；進樣口溫度為200 ℃，程序升溫，起始溫度50 ℃，維持1 min，以每分鐘10 ℃升溫至300 ℃；進樣體積1 μL。以三重四極桿串聯質譜儀檢測；離子源為電子轟擊源（EI），質譜監測模式為多反應監測（MRM）。結果 經方法學驗證，混合對照品溶液各峰分離良好，對甲基苯磺酸甲酯、乙酯、異丙酯分別在0.002485～0.1863 μg/mL、0.002019～0.1514 μg/mL 、0.001879～0.1409 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，在0.05～0.15 μg/mL濃度范圍內回收率為94.5%～113.7%，方法檢出靈敏度低于1%TTC。結論 該方法準確可靠，適用于托西酸舒他西林中對甲基苯磺酸烷基酯的測定。按該方法形成質量標準草案，并采用擬修訂方法對生產企業提供的6批樣品進行測定，6批樣品均符合規定。

關鍵詞：托西酸舒他西林；對甲基苯磺酸甲酯；對甲基苯磺酸乙酯；對甲基苯磺酸異丙酯；氣相色譜-三重四極桿質譜聯用

中圖分類號：R917文獻標志碼：A

Study on the determination of p-toluenesulfonic acid alkyl ester

in sultamicillin tosilate

Yao Lan， Fu Rong， Zou Yu， and Sun Lingling

（Liaoning Institute for Drug Control， Shenyang 110032）

Abstract Objective A gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry （GC-MSMS） method was developed for the determination of alkyl p-toluenesulfonate. Method An elastic quartz capillary column with （5%-phenyl）-methylpolysiloxane as stationary liquid was used as the chromatographic column. The inlet temperature is 200 ℃. The column temperature was programmed. The starting temperature was set at 50 ℃ for 1 minute， and then the temperature was increased to 300 ℃ at a rate of 10 ℃ per minute; the injection volume was 1 μL. The Electron Ionization source （EI） was used as the ion source， and the monitoring mode was multiple reaction monitoring （MRM）. Result The results showed that the peak area of methyl p-toluenesulfonate， ethyl p-toluenesulfonate， and isopropyl p-toluenesulfonate had a good linear relationship in the concentration range of 0.002485～0.1863 μg/mL， 0.002019～0.1514 μg/mL and 0.001879～0.1409 μg/mL， respectively. The recovery rates were 94.5%～113.7% in the range of 0.05～0.15 μg/mL， respectively. The detection sensitivity concentration was less than 1% TTC. Conclusion The method was accurate and reliable. According to this method， a draft of quality standard was formed， and 6 batches of samples were determined by the proposed method. All 6 batches of samples met the requirements.

Key words Sultamicillin tosilate; Methyl p-toluenesulfonate; Ethyl p-toluenesulfonate; Isopropyl p-toluenesulfonate; Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry

托西酸舒他西林收載于《中國藥典》2020年版[1]，為舒他西林對甲基苯磺酸鹽。《中國藥典》2020年版[1]該品種[生產要求]項下要求：應對生產工藝進行評估以確定形成遺傳毒性雜質甲苯磺酸烷基酯的可能性。必要時，應采用適宜的分析方法對產品進行分析，以確認甲苯磺酸酯的含量符合國家藥品監督監管部門相關指導原則或ICH M7指導原則的要求。

根據生產單位提供的工藝，托西酸舒他西林生產主要使用的溶劑包含甲醇、異丙醇、乙酸乙酯等，成鹽試劑對甲苯磺酸與溶劑有形成對甲基苯磺酸甲酯、對甲基苯磺酸乙酯、對甲基苯磺酸異丙酯的可能性，磺酸烷基酯為帶有基因毒性警示結構化合物[2]，對甲基苯磺酸烷基酯屬帶有基因毒性警示結構無致突變性數據化合物，應采用適宜的方法控制該類雜質不高于可接受限度。

根據ICH M7中毒理學關注閾值（TTC）的建議[3]，具有誘變性的雜質每天每人攝入1.5 μg時其風險是可以忽略的（終生暴露情況下理論的患癌風險小于十萬分之一），可以通用于大部分藥物作為可接受限度控制標準。托西酸舒他西林成人推薦使用量為最大每次0.75 g，每日兩次（共1.5 g）。照上述控制標準，1.5 μg /1.5 g應作為該品種該類雜質可接受的限度控制標準，即1 ppm。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

三重四極桿氣質聯用儀：Agilent7890B-7000C三重四極桿氣質聯用儀

天平： XP205 （Mettler Toledo）

1.2 試劑與對照品

試驗使用的試劑與對照品詳見表1。

1.3 供試品

生產企業提供的托西酸舒他西林原料藥6批，批號C04200501、C04200502、C04200503、C04210101、C04210102、C04210103。

1.4 色譜柱

HP-5（19091J-413）30 m×0.320 mm，0.25 μm；DB-5（122-5032） 30 m×0.25 mm，0.25 μm。

2 方法與結果

2.1 研究方法

對甲基苯磺酸甲酯、對甲基苯磺酸乙酯、對甲基苯磺酸異丙酯照氣相色譜法（《中國藥典》2020年版通則0521）和質譜法（通則0431）測定。

2.1.1? ? 供試品溶液

取供試品約1.0 g，精密稱定，置具塞（膠塞）試樣瓶中，將試樣瓶置冰水浴中冷卻，加甲基叔丁基醚10 mL，立即旋緊膠塞，室溫下振搖20 min，靜置5 min，取上清液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.1.2? ? 混合對照品貯備溶液

取對甲基苯磺酸甲酯、對甲基苯磺酸乙酯與對甲基苯磺酸異丙酯對照品適量，精密稱定，加甲基叔丁基醚溶解并稀釋制成分別約含10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3? ? 系列混合對照品溶液

精密量取混合對照品貯備溶液適量，用甲基叔丁基醚稀釋制成每1 mL分別約含2、10、50、100和150 ng系列混合對照品溶液。

2.1.4? ? 靈敏度溶液

取每1 mL分別約含2 ng的混合對照品溶液，作為靈敏度溶液。

2.1.5? ? 色譜條件

以（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱為色譜柱；進樣口溫度200 ℃；分流比1︰1；載氣為高純氦氣（He），流速2.0 mL/min；程序升溫，起始溫度50 ℃，維持1 min，以每分鐘10 ℃升溫至300 ℃；進樣體積1 μL。

2.1.6? ? 質譜條件

以三重四極桿串聯質譜儀檢測；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度200 ℃；碰撞氣為氮氣，流速1.5 mL/min；輔助加熱器（MSD傳輸線）溫度為300 ℃；質譜監測模式為多反應監測（MRM）；監測離子對、碰撞電壓（CE）參考值見表2；為提高檢測靈敏度，可根據保留時間分段監測各化合物。

2.1.7? ? 系統適用性要求

精密量取混合對照品溶液（150 ng/mL）連續進樣，對甲基苯磺酸異丙酯峰面積的相對標準偏差不得過5.0%，各色譜峰之間的分離度應符合要求。以上符合要求情況下，進行線性關系的考查。系列混合對照品溶液色譜圖中，計算各成分濃度與相應峰面積的線性回歸方程，相關系數（r）應不小于0.99。靈敏度溶液色譜圖中，對甲基苯磺酸甲酯峰、對甲基苯磺酸乙酯峰及對甲基苯磺酸異丙酯峰的信噪比，均應不小于10。

2.1.8? ? 測定法

精密量取系列混合對照品溶液、供試品溶液與靈敏度溶液，分別注入氣相色譜-串聯質譜儀，記錄色譜圖和質譜圖。

2.1.9? ? 限度

供試品溶液色譜圖中如檢出與對照品保留時間相同的色譜峰，并且在扣除背景后的質譜圖中，所選擇的2個監測離子對均出現，供試品溶液的監測離子對峰面積比（比值=定性離子峰面積/定量離子峰面積×100%）與濃度相當的對照品溶液的監測離子對峰面積比進行比較時，相對偏差不超過下列規定的范圍，則可判定樣品中存在該雜質：相對比例＞50%，允許±20%偏差；相對比例20%～50%，允許±25%偏差；相對比例10%～20%，允許±30%偏差；相對比例≤10%，允許±50%偏差。按標準曲線法以峰面積計算，含對甲基苯磺酸甲酯、對甲基苯磺酸乙酯與對甲基苯磺酸異丙酯分別不得過1 ppm。小于靈敏度溶液主峰面積的峰忽略不計。

2.2 方法學研究結果

2.2.1 專屬性

對甲基苯磺酸甲酯、對甲基苯磺酸乙酯、對甲基苯磺酸異丙酯EI源（70 ev）質譜圖見圖1，根據離子響應選擇定量與定性參考離子見“2.1.6”質譜條件。

精密吸取對照品溶液、供試品溶液與空白溶液，照上述“2.1”方法，各進樣1 μL，結果混合對照品溶液各峰分離良好，溶劑與樣品基質不干擾測定，方法專屬性良好。典型色譜圖見圖2～6。

2.2.2 準確度與重復性

取供試品（批號C04200502）1.0 g，共9份，每組3份，精密稱定，置具塞試樣瓶中，將試樣瓶置冰水浴中冷卻，每組樣品分別精密加入低、中、高混合對照溶液（濃度分別為0.05、0.10、0.15 μg/mL）

10 mL，密閉，室溫振搖20 min，靜置5 min，用

0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。照“2.1”方法，每樣品進樣兩次，結果表明：各樣品回收率良好，以回收率的樣品間RSD考察重復性，樣品間重復性符合要求，方法準確可靠，結果見表3。

2.2.3 檢測限與定量限

精密稱取對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸異丙酯對照品各適量，用甲基叔丁基醚溶解并逐級稀釋，以信噪比10為定量限，信噪比3為檢測限，各雜質定量限與檢測限結果見表4，典型圖譜見圖7～10。1 ppm應作為該品種該類雜質可接受的限度控制標準，檢測限濃度均能夠滿足ICH M7推薦的雜質可忽略限度（0.01 ppm）。

2.2.4 定量限精密度與準確度

取定量限溶液，連續進樣6次，并計算峰面積相對標準偏差考察精密度。取供試品6份，每份1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞試樣瓶中，各加定量限溶液10 mL，密閉，振搖20 min，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得，照"2.1"方法，進樣1 μL計算回收率。精密度與準確度結果見表5。結果表明，精密度與回收率結果良好。

2.2.5 線性與范圍

精密稱取對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯、對甲苯磺酸異丙酯對照品各適量，用甲基叔丁基醚溶解并逐級稀釋，制成線性系列溶液，照“2.1”方法，進樣1 μL，各雜質線性范圍內峰面積與濃度線性關系良好，r值不小于0.9992。線性與范圍結果見表6。

2.6 耐用性

采用DB-5 （122-5032） Length30 m×Diam.0.25 mm Film 0.25 μm色譜柱，照“2.1”方法，進樣混合對照溶液（約0.05 μg/mL），結果各峰分離良好。色譜圖見圖11，表明方法耐用性良好。

2.3 樣品測定結果

取供試品1.0 g，精密稱定，精密加入甲基叔丁基醚10 mL，振搖20 min，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，進樣1 μL。按外標標準曲線法計算，結果見表7。有1批檢出對甲基苯磺酸異丙酯，其余樣品均未檢出，6批樣品均符合規定。

3 討論

綜上研究，該方法簡便、結果準確可靠，適用于托西酸舒他西林中對甲基苯磺酸甲酯、乙酯、異丙酯的檢測。根據檢驗結果，該企業樣品中該類雜質控制良好，雜質未檢出或痕量檢出。根據ICH M7中毒理學關注閾值（TTC）的建議，低于1%TTC雜質可以忽略不計，該方法檢測靈敏度能夠滿足1%TTC，可以滿足該雜質的質量控制。《歐洲藥典》收載GC-MS法測定甲磺酸甲酯、乙酯、異丙酯，采用衍生化法使待測物沸點降低，使滿足頂空法要求，本文中待測物無法通過衍生化法滿足頂空法要求。有文獻報道采用液質聯用方法測定該類雜質，因該類雜質易水解，液質法不滿足測定需求。本文采用GC-MSMS直接進樣法，由于樣品濃度較大（0.1g/mL），對系統污染嚴重。因此選擇甲基叔丁基醚作為溶劑，托西酸舒他西林與對甲基苯磺酸烷基酯的在該溶劑中溶解性差異較大，溶劑能夠提取樣品中的待測物，并使原料藥對測定無干擾。測定中發現，對甲基苯磺酸異丙酯存在進樣口吸附的現象，因此，方法先以雜質對照品濃溶液對進樣口進行充分的預飽和，結果較理想。

參 考 文 獻

國家藥典委員會 中華人民共和國藥典[S].（2020年版二部）. 北京： 中國醫藥科技出版社 2020： 434-435

Snodin D J. Genotoxic impurities： from structural alerts to qualification [J]. Org Process Res Dev， 2010， 14（4）： 960-976.

ICH.ICH Harmonized Guideline， Assessment and Control of DNA Reactive （Mutagenic） Impurities in Pharmaceuticals To Limit Potential Carcinogenic Risk M7（R1）[S/OL].（2017-3-31）[2022-9-21]. https：//database.ich.org/sites/default/files/M7_R1_Guideline.pdf.