鯽魚源殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

王淑嫻，許拉，于曉清，刁菁，王曉璐，蓋春蕾，葉海斌

（山東省海洋科學(xué)研究院/海洋食品與醫(yī)藥研究中心，山東 青島 266104）

鯽（Carassius auratus）是鯉科（Cyprinidae）、鯽屬（Carassius），為淡水性魚類。1 000 多年前，鯽在中國被馴化，于16 世紀(jì)引入日本，之后又被引入歐洲和世界大部分地區(qū)。除西部高原地區(qū)外，鯽廣泛分布于我國各地[1]。鯽肉質(zhì)細嫩而鮮美，并且還具有健脾利濕、和中開胃、活血通絡(luò)、溫中下氣的功效，對脾胃虛弱、水腫、潰瘍、氣管炎、哮喘、糖尿病有很好的滋補食療作用[2]。近年來，鯽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅速，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，加之養(yǎng)殖戶對水質(zhì)綜合調(diào)控的重視程度不夠，養(yǎng)殖環(huán)境條件日趨惡化，各種病害接踵而至，嚴重影響了鯽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

2022 年5 月，山東某鯽養(yǎng)殖場暴發(fā)病情，大量鯽死亡，個體長5～10 cm，部分瀕死鯽出現(xiàn)體表充血、潰爛、鱗片易脫落和爛鰓等現(xiàn)象。現(xiàn)從瀕死鯽的體表出血、潰爛、脫鱗及內(nèi)臟等部位，分離純化獲得一株優(yōu)勢菌株，并利用生理生化、Biolog GenIII 微生物鑒定系統(tǒng)和分子生物學(xué)方法，對該菌進行鑒定，旨在為生產(chǎn)中鯽的疾病防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

細菌培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TrypticSoy Agar, TSA）購自青島海博生物有限公司，生理生化鑒定管購自北京陸橋生物有限公司，細菌快速鑒定板購自美國Biolog 公司，其他化學(xué)試劑和引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)勢菌株分離純化

從患病鯽的體表出血、潰爛、脫鱗及內(nèi)臟等部位剪取少量組織，經(jīng)TSA 培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)（30 ℃，24 h），取優(yōu)勢菌落，繼續(xù)轉(zhuǎn)接TSA 培養(yǎng)基至純培養(yǎng)，置于超低溫冰箱（－80 ℃）中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落形態(tài)、理化特性檢測及Biolog 分析

將分離獲得的純培養(yǎng)菌接種于TSA 平板上，30 ℃培養(yǎng)20 h 后，觀察菌落特征，同時進行革蘭染色和顯微觀察。在無菌條件下，將供試菌株分別接入生理生化鑒定管中，培養(yǎng)24 h 后，按照產(chǎn)品說明書，對每個培養(yǎng)基小管的顏色進行比較、記錄和分析。將調(diào)整好濃度的供試菌株接入GenIII 第三代鑒定板，培養(yǎng)24 h 后，通過測試板上的“表型指紋”分析結(jié)果。

1.2.3 16S rDNA 基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

挑取單一菌落懸浮于無菌去離子水中，100 ℃下水浴5 min，冷卻后在4 ℃條件下以10 000 r/min離心10 min，上清液即為PCR 擴增反應(yīng)的模板。在25 μL PCR 反應(yīng)體系中含有：無菌水 10.5 μL，引物各 0.5 μL（16S rDNA 通用引物 27F，1492R），模板1 μL，Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）12.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸 l min 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃溫育 10 min。吸取 6 μL 的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察。PCR 擴增產(chǎn)物由上海生物工程技術(shù)公司進行基因序列測定。測序結(jié)果登陸GenBank 進行BLast 比對，采用MEGA 4.0 軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數(shù)集1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病鯽優(yōu)勢菌的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察

從瀕死病魚的病灶處，分離獲得一株形態(tài)、大小一致的優(yōu)勢菌，命名為JY-1，其在TSA 平板上生長菌落形態(tài)為圓形、灰白色和邊緣光滑。經(jīng)革蘭染色鏡檢得知，優(yōu)勢菌株為革蘭陰性菌，短桿狀，兩端鈍圓，無鞭毛，菌體周圍生有許多細小的菌毛。

2.2 菌株JY-1 生理生化特征及Biolog 分析

通過北京陸橋生物有限公司生化鑒定管試驗，優(yōu)勢菌的生理生化特性見表1。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊（第八版）》[3]，對比各項指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與氣單胞菌屬相近。

表1 供試菌JY-1 生化反應(yīng)結(jié)果①

通過Biolog GenIII 第三代鑒定板檢測發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)鑒定該菌株為殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida），相似度（SIM）為 0.532，位距（DIST）為 4.138。

2.3 16S rDNA 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

擴增獲得菌株JY-1 的16S rDNA 基因序列長度為1 435 bp，測序后通過NCBI 上Blast 進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與殺鮭氣單胞菌的16S rDNA 基因序列同源性最高，一致性達99.79%。從Genebank 上選取典型的序列，包括殺鮭氣單胞菌、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、燦爛弧菌（Vibrio splendidus）的16S rDNA 基因序列，利用MEGA 4.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果見圖1。由圖1 可見，細菌JY-1 與殺鮭氣單胞菌（CP022550.1、CP022426.1和CP038102.1）聚合在一起。

圖1 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)細菌JY-1 的生理生化特征、Biolog 分析、16S rDNA 基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，將細菌JY-1 鑒定為殺鮭氣單胞菌。

3 討論

殺鮭氣單胞菌屬氣單胞菌科（Aeromonadaceae），氣單胞菌屬（Aeromonas）[4]，是一種不能運動、兼性厭氧的革蘭陰性菌。這種菌自19 世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)及之后的很長一段時間，主要感染冷水性魚類，還能夠感染鯉（Cyprinus carpio）、河鱸（Perca fluviatilis）、六線魚（Hexagrammosotakii）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和大西洋鱈（Gadus morhua）等[5]。楊嘉龍等[6]從患病刺參病灶處分離得到一株殺鮭氣單胞菌，該菌引起刺參出現(xiàn)潰瘍癥狀。龍夢等[7]首次報道了圓口銅魚（Coreius guichenoti）疥瘡病，從患病圓口銅魚的肝臟中分離到一株殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種（Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida）。近年來，殺鮭氣單胞菌感染哺乳動物的報道也不斷出現(xiàn)[8]，其感染范圍擴大的同時，殺鮭氣單胞菌也在發(fā)生著溫度適應(yīng)性變化。

本研究從患病的鯽體內(nèi)分離獲得一株優(yōu)勢菌JY－1，該菌株會引起魚體表潰爛、充血、爛鰓、鱗片脫落、鰭條發(fā)紅、腸道充血等癥狀。該菌株形態(tài)學(xué)、生理生化結(jié)果顯示，其與氣單胞菌屬最接近。BiologGenIII微孔板可對細菌進行71 種碳源利用測試以及23種化學(xué)敏感性測試。細菌在測試板上所顯示出的“表型指紋”被用來在種水平上鑒定微生物。本研究中，Biolog GenIII 分析鑒定該菌株為殺鮭氣單胞菌。另外，通過16S rDNA 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)細菌JY-1 的16S rDNA 基因序列與已報道的殺鮭氣單胞菌（CP 022550.1、CP 022426.1 和CP 038102.1）16S rDNA 基因序列的相似性高達99%以上，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，JY-1 菌株與殺鮭氣單胞菌聚為一支。