食管癌手術與非手術切除患者腸道菌群組成及差異

王文浩，萬里新，尚付梅，陶海云

(1.河南大學臨床醫學院，河南 開封 475000；2.南陽市中心醫院，河南 南陽 473000；3.廣西科技大學第一附屬醫院，廣西 柳州 545000)

食管癌是原發于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，主要為鱗癌和腺癌，鱗癌多發于亞洲東部，腺癌多發于歐美國家[1]，食管癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤，《2020年全球癌癥中心報告》顯示，2020年全球食管癌發病人數60.4萬例，發病率居全球惡性腫瘤第8位，死亡人數54.4萬，死亡率居全球惡性腫瘤第6位[2]；食管癌的發生發展是多因素作用的結果，隨著宏基因組和二代測序技術的發展，人們發現腸道微生物與消化道腫瘤的發生發展息息相關[3-4]。腸道微生物在人體內保持著一個動態平衡，當此動態平衡遭到破壞時，就會導致腸道內有益菌的減少和有害菌的增加，從而導致各種疾病的發生；腸道菌群紊亂與炎癥性腸病、腸易激綜合征、糖尿病等疾病的發生發展有著一定的關系[5-6]。研究表明，食管癌的發生發展與食管黏膜微生物的變化密切相關，Gao等[7]發現牙齦卟啉單胞菌在食管癌中有致病作用，但食管癌的發生與腸道微生物的改變是否有關，目前尚不明確；通過手術方式切除食管腫瘤后，對腸道菌群的變化產生何種影響，目前仍未可知，需要進一步去探索。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2021年11月至2022年3月南陽市中心醫院收治的食管癌患者，其中手術切除患者21例，非手術切除患者20例。納入標準：經組織學或細胞學確診為食管癌。排除標準：(1)2周內應用過抗生素或益生菌；(2)目前患有腹瀉或腸梗阻等其他消化道疾病；(3)合并其他部位惡性腫瘤病史；(4)手術患者接受過除手術外的其他抗腫瘤治療(放療、化療、免疫及靶向治療等)；(5)非手術患者既往接受過抗腫瘤治療。從醫療記錄中收集其臨床數據，包括姓名、性別、年齡、吸煙飲酒史、家族史、腫瘤生長部位、病理類型、分化程度、臨床分期等。所有研究對象在參加本研究之前均簽署了書面知情同意書，且該研究已通過南陽市中心醫院臨床試驗倫理委員會批準。

1.2 標本收集及檢測分析方法

1.2.1糞便標本收集 收集患者治療前的糞便標本，囑其排便前先排空小便，將大便排入準備好的器皿內，并囑其盡量勿將尿液排入器皿，避免糞便標本受到污染，用一次性無菌牙簽或糞便取樣器挑取約2 g中段內部大便放入到寫有編號凍存管中，置入液氮中保存。

1.2.2糞便細菌DNA提取及測序 運用Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取糞便標本中細菌DNA，利用Illumina測序方法對細菌16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，運用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒構建高通量測序文庫。

1.2.3序列去噪及功能基因矯正 運用QIIME2(2019.4)軟件調用切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，通過DADA2[8]進行質控、去噪、拼接、去嵌合體后得到ASVs。完成對所有文庫的去噪后，合并ASVs特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs。使用R語言對全部樣本中所包含的高質量序列的長度分布進行統計，并對核酸序列中的插入和缺失錯誤進行糾正。

1.2.4物種分類學注釋及ASV表抽平 通過QIIME2中的classify-sklearn[9]算法對每個ASVs的特征序列進行物種分類學注釋，再使用qiime feature-table rarefy功能在每個樣本中分別隨機抽取一定數量的序列以到達統一的深度，并預測各樣本在該測序深度下，所能觀測到的ASVs及其相對豐度[10]，抽平深度設為最低樣本序列量的95%。

1.2.5微生物多樣性及分類分析 微生物Alpha多樣性分析是使用未抽平的ASV表，通過運用QIIME2、R語言計算Alpha多樣性指數，包括Chao1指數、Observed species指數、Shannon指數、Faith’s PD指數、Pielou指數、Good’s coverage指數，來評估組內微生物的均勻度和豐富度；Beta多樣性是通過R腳本對bray-curtis距離矩陣進行NMDS分析，以三維排序圖展示微生物群落的組間差異。

2 結果

2.1 手術組與非手術組食管癌患者的臨床特征本研究共納入41例食管癌患者，男32例，女9例；年齡為53～85歲，平均(66.59±8.31)歲；病理類型中鱗癌患者有36例，腺癌患者有5例；手術患者21例，非手術患者20例，手術組與非手術組患者間的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、病理類型及臨床分期差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 手術與非手術患者基本臨床特征

2.2 食管癌患者糞便標本測序結果本研究中，共41份糞便標本進行16S rRNA高通量測序，共得到4 630 070條有效序列，去噪后得到4 047 187條序列，聚類去嵌合體及功能基因矯正后共得到2 687 172條高質量序列，每條序列平均長度為416.5 bp，平均每個樣品有886個ASV，分類注釋后共得到29門、70綱、126目、228科、497屬、698種。

2.3 手術組與非手術組食管癌患者菌群Alpha多樣性分析本研究采用QIIME2(2019.4)軟件對數據加以分析，使用R腳本對數據處理并繪制成箱線圖，以此來直觀地展示不同樣分組間的Alpha多樣性及差異，研究結果顯示，兩組間Chao1指數、Observed species指數、Shannon指數、Simpson指數、Faith’s PD指數、Pielou指數、Good’s coverage指數差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。手術組與非手術組食管癌患者之間的Alpha多樣性差異無統計學意義。

S_TX為手術患者；NS_TX為非手術患者。圖1 Alpha多樣性指數

2.4 手術組與非手術組食管癌患者菌群組成結構本研究通過采用ASV在所有樣本中的豐度數據，將每個分組作為一個集合，按樣品的分組情況統計每個集合中的ASV，并計算各個集合之間的關系，得到兩組所共有和獨有的ASV數量，即Venn圖(圖2)，其中有2 697個ASV是兩組間共有的，有10 088個ASV是手術組患者所獨有的，有9 226個ASV是非手術組患者獨有的；通過QIIME2軟件對去除singleton后的特征表進行統計分析，兩組患者腸道微生物在門水平的主要優勢細菌分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門、互養菌門、梭桿菌門、軟壁菌門(圖3)；在屬水平上，手術組中的鏈球菌屬(11.36%比4.58%)、雙歧桿菌屬(10.06%比4.59%)、糞桿菌屬(5.11%比4.57%)、布勞特氏菌屬(4.33%比3.59%)的菌群豐度比非手術組高，非手術組中的志賀菌屬(12.07%比6.03%)、擬桿菌屬(8.79%比6.51%)、乳桿菌屬(6.14%比5.36%)、羅氏菌屬(2.86%比2.33%)的菌群豐度要比手術組高(圖4)。

圖2 韋恩圖

圖3 門水平菌群相對豐度

圖4 屬水平菌群相對豐度

2.5 手術組與非手術組食管癌患者菌Beta多樣性分析本研究通過對bray-curtis距離矩陣進行NMDS分析，采用Anosim非參數檢驗分析方法比較，比較兩組之間的菌群差異，結果顯示手術組與非手術組間腸道微生物群落差異有統計學意義(R=0.067，P=0.040)。見圖5。

圖5 NMDS分析(P=0.04)

2.6 手術組與非手術組食管癌患者菌LEfSe分析LEfSe分析是一種差異分析方法，本研究通過描述顯著差異物種LDA值分布柱狀圖，來展示每個組內顯著富集的物種。LEfSe分析結果顯示，手術組與非手術之間微生物群落存在差異，手術組微生物富集區包括：乳桿菌目(LDA得分4.65，P=0.047)、鏈球菌科(LDA得分4.58，P=0.042)、放線菌科(LDA得分4.43，P=0.044)、雙歧桿菌科(LDA得分4.42，P=0.019)、韋榮球菌(LDA得分4.11，P=0.017)、梭桿菌屬(LDA得分2.99，P=0.011)、月形單胞菌屬(LDA得分2.72，P=0.014)(圖6)；非手術組中有6種微生物顯著富集，主要包括小桿菌屬(LDA得分4.01，P=0.036)、馬賽菌屬(LDA得分3.33，P=0.019)、螺桿菌屬(LDA得分3.29，P=0.033)、消化球菌屬(LDA得分2.62，P=0.045)、巨單胞菌屬(LDA得分2.57，P=0.012)、微單胞菌屬(LDA得分2.49，P=0.041)。

圖6 LEfSe分析

3 討論

人體腸道中存在著至少100萬億種微生物，共同影響著人體的免疫系統及健康狀況，包括癌癥的發生[11-13]。飲食習慣、生活方式及藥物等都可以影響腸道菌群的組成，腸道微生物通過維持腸道黏膜屏障的完整性、營養代謝、免疫調節等功能來維持人體內環境穩態[14-16]。人體腸道微生物處于動態平衡，當此平衡遭到破壞時，菌群結構和豐度會發生一定的變化，進而導致病理學的改變及一些疾病的發生[17]，因此腸道菌群在維持人體正常生理功能中起著至關重要的作用，又被稱為人體“被遺忘器官”[18]。

研究發現，食管病變與食管內菌群特征緊密相關，YANG等[19]通過16S rRNA測序技術描述了正常食管、反流性食管炎及巴雷特食管患者遠端食管菌群的多樣性，Pei等[20]對健康人群食管研究發現，在門水平上食管菌群中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門豐度較高，占比95.1%。本研究發現，在門水平上，食管癌患者腸道菌群主要優勢菌門分別為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，占比95%左右，提示在門水平食管微生態與胃腸道微生態微生物群落差異無統計學意義。另有研究表明，與健康成年人相比，食管癌患者口腔內厚壁菌門豐度顯著增加[21-22]；而本研究發現，手術組厚壁菌門豐度要低于非手術組，推測可能原因為通過手術切除腫瘤，減輕腫瘤負荷作用，進而影響腸道微環境。Gall等[23]發現，鏈球菌和普雷沃菌在巴雷特食管患者的食管微生物群中占主導地位，鏈球菌和普雷沃菌的比值與食管腺癌的一些風險因素有密切關系；本研究并未在食管癌患者腸道菌群中檢測到上述2種菌群的差異，表明食管微生態與胃腸道微生態在屬水平上存在差異，可能原因為細菌從上消化道至下消化道的轉運過程中受到胃液、胰液以及某些代謝作用的影響，進而促使腸道菌群發生改變。

對于早期食管癌患者，手術切除仍為主要治療手段[24]，但術口感染、吻合口瘺等術后并發癥發生率依然很高。研究表明，腸道微生物會對術后患者的預后產生影響。Bachmann等[25]發現腸道微生物對結直腸癌術后吻合口的愈合有較大的影響，宣煜龍等[26]發現口腔及胃內微生物群組成不同可致吻合口瘺發生率增加。為了探索手術切除食管腫瘤引起的腸道菌群差異，本研究對食管癌患者手術與非手術組腸道菌群的Alpha及Beta多樣性加以分析，發現兩組間的Chao1指數、Observed species指數、 Shannon指數、Simpson指數、Faith’s PD指數、Pielou指數、Good’s coveragecha指數差異無統計學意義，表明兩組間菌群豐富度、多樣性、均勻度、覆蓋度相似；但NMDS分析表明，兩組間微生物組成有所不同，提示手術切除腫瘤，對腸道微環境的變化產生影響，進而影響菌群組成。平貫芳等[27]發現消化道腫瘤會導致腸道內乳桿菌及雙歧桿菌豐度顯著減少，本研究通過LEfSe分析，評估兩組間腸道微生物的組成差異，發現與非手術組相比，乳桿菌目與雙歧桿菌等有益菌在手術組中較富集，推測由于通過手術切除腫瘤，減輕腫瘤負荷，進而改變腫瘤微環境，更適合有益菌群的增長。而夏冰清等[28]發現結直腸癌患者術后腸道內乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌的豐度較術前減少，這與本研究結果存在差異，考慮可能原因為結直腸癌根治術在切除腫瘤的同時，也直接破壞了腸道微環境，食管癌患者的發病部位位于上消化道，手術切除食管腫瘤，僅消除腫瘤對腸道微環境的影響，并未對腸道微環境造成直接破壞；而非手術組中有益菌減少，有害菌增加，這是否與腫瘤改變胃腸道生理，進而導致腸道菌群結構發生變化，需要進一步探索。

本研究為小樣本量關于食管癌患者手術與非手術組腸道菌群組成及差異的研究，排除了抗生素、益生菌及其他胃腸道疾病對試驗結果的影響，并嚴格遵循糞便收集標準，及時保存送檢。本研究局限在于樣本量小，部分差異無統計學意義，下一步將擴大樣本量，繼續往下探索腸道微生物對食管癌患者手術切除與非手術切除預后的影響。

綜上，本研究發現食管癌患者手術切除與非手術切除腸道菌群組成存在差異，手術組較非手術有益菌群組富集，考慮通過手術切除食管腫瘤，減輕腫瘤負荷，由此改變了腫瘤對胃腸道生理環境的影響。