腦泰方含藥血清對缺氧缺糖/復氧PC12細胞損傷的保護作用

宋洋　陳瑤　胡立娟　王璇　葛金文

〔摘要〕 目的 探討腦泰方含藥血清通過內質網應激相關通路調控缺氧缺糖/復氧PC12細胞凋亡，從而闡明腦泰方對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制。方法 將PC12細胞分為正常組（常規培養）、模型組（OGD/R）、抑制劑（4-PBA）組及腦泰方低濃度（10%）、中濃度（15%）、高濃度（20%）組。CCK8法檢測細胞活力；采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）試劑盒檢測LDH活性；Hoechst 33258染色觀察細胞核形態變化；Tunel染色檢測細胞凋亡率；免疫熒光法和Western blot檢測細胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達情況。結果 模型組LDH活性增加，細胞凋亡率增加，細胞存活率下降（P＜0.01），GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達明顯增加，LC3Ⅰ蛋白表達減少（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，抑制劑（4-PBA）組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組LDH活性降低，細胞凋亡率減少，細胞存活率明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達明顯降低，LC3Ⅰ蛋白表達明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。結論 腦泰方含藥血清可有效抑制缺氧缺糖/復氧PC12細胞的凋亡，調控GRP78/PERK/CHOP信號通路，表明腦泰方可能緩解受損神經細胞內質網應激導致的過度自噬狀態，進而抑制細胞凋亡，發揮一定的神經保護作用。

〔關鍵詞〕 腦泰方；腦缺血再灌注損傷；缺氧；缺糖；復氧；內質網應激；自噬

〔中圖分類號〕R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.009

Protective effects of Naotai Formula medicated serum on oxygen-glucose

deprivation/reoxygenation-induced injury of PC12 cells

SONG Yang CHEN Yao HU Lijuan WANG Xuan GE Jinwen

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the regulation of Naotai Formula medicated serum on the apoptosis of PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） through endoplasmic reticulum stress-related pathways， so as to demonstrate the mechanism of Naotai Formula's protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）. Methods PC12 cells were divided into normal group （conventional culture）， model group （OGD/R）， inhibitor （4-PBA） group and low- （10%）， medium- （15%） and high- （20%） concentration Naotai Formula groups. CCK8 method was used to examine cell viability; LDH activity was detected by LDH quantification kit. Hoechst 33258 staining was used to observe the nuclear morphological changes and the apoptosis rate was checked by Tunel staining. The expressions of Beclin-1， LC3， GRP78， CHOP and PERK proteins was examined by immunofluorescence method and the Western blot. Results In the model group， the LDH activity of PC12 cells increased， the apoptosis rate increased and the cell survival rate decreased （P<0.01）， the expressions of GRP78， PERK， CHOP， LC3Ⅱ， and Beclin-1 were notably elevated， while LC3Ⅰ expression was lower （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， the LDH activity of PC12 cells in the inhibitor （4-PBA） group， the medium- and high- concentration groups of Naotai Formula decreased， the apoptosis rate was lower and the cell survival rate increased significantly （P<0.05， P<0.01）. The expressions of GRP78， PERK， CHOP， LC3Ⅱand Beclin-1 proteins were reduced significantly， while the expression of LC3Ⅰ protein increased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Naotai Formula medicated serum can effectively inhibit the apoptosis of PC12 cells induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation and regulate the GRP78/PERK/CHOP signaling pathway. It indicates that Naotai Formula may alleviate the excessive autophagy caused by endoplasmic reticulum stress of the injured nerve cells， and then inhibit the apoptosis of cells， so as to play a certain neuroprotective role.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Naotai Formula; cerebral ischemia-reperfusion injury; oxygen deprivation; glucose deprivation; reoxygenation; endoplasmic reticulum stress; autophagy

缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）是腦卒中最常見的類型，具有高發病率、高死亡率、高致殘率等特點[1]。目前，血管內溶栓是治療IS的主要手段，但當腦缺血責任血管再通后常繼發腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI），導致更加嚴重的腦功能障礙。CIRI發病機制較復雜，主要包括內質網應激（endoplasmic reticulum stress， ERS）、自噬、炎癥反應等[2]。研究發現，當CIRI發生時大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網（endoplasmic reticulum， ER）中會進一步蓄積，跨膜受體被激活，進一步誘導未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）的發生，從而減輕未折疊或錯誤折疊蛋白的積累[3]，然而當UPR不能有效代償ERS時，會激活促凋亡相關通路，加速細胞的凋亡[4]。因此，抑制ERS或可成為防治CIRI的關鍵靶點。腦泰方具有補氣活血、化瘀通絡的功效，對IS氣虛血瘀證患者具有良好的臨床效果[5]。本研究擬建立缺氧缺糖/復氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）PC12細胞模型體外模擬CIRI，然后使用不同濃度腦泰方含藥血清進行給藥培養，檢測細胞存活情況及GRP78、CHOP、PERK、Beclin-1、LC3蛋白表達，旨在基于ERS相關通路探討腦泰方對CIRI腦組織損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1? 動物與細胞

SPF級雄性SD大鼠8只，體質量180～200 g，湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SYXK（湘）2021-0005。本研究由湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會審核批準，審查號：2021-0086。高分化PC12細胞株購自武漢普諾賽生命科技公司（批號：CM0481）。

1.2? 主要試劑與儀器

4-苯基丁酸購自美國MedChemexpress公司（批號：HY-A0281）；DMEM培養液、胎牛血清均購自美國Gibco公司（批號分別為19106、8121279）；LDH試劑盒購自南京建成生物科技公司（批號：20211218）；CCK8檢測試劑盒購自北京博奧森生物科技公司（批號：BA08198127）；Tunel凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術公司（批號：C1086）；兔抗大鼠Beclin-1抗體、兔抗大鼠LC3-B抗體、兔抗大鼠LC3-A抗體、兔抗大鼠GRP78抗體、兔抗大鼠CHOP抗體、兔抗大鼠PERK抗體均購自美國Affinity公司（批號分別為AF-5128、AF-4650、AF-4007、AF-5366、DF-6025、AF-5304）；Hoechst 33258購自北京索萊寶科技公司（批號：B8030）。

低速離心機（湖南湘儀實驗儀器公司，型號：7DZ5-WS）；多功能酶標儀（美國Perkinelmer公司，型號：Enspire）；二氧化碳細胞培養箱（美國Thermo公司，型號：HERACE）；細胞成像分析系統（廣州明美顯微儀器公司，型號：MSX2）；超高分辨激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司，型號：LSM880）。

1.3? 腦泰方含藥血清制備

腦泰方由黃芪50 g、川芎12.5 g、地龍18.75 g、僵蠶18.75 g組成。腦泰方濃縮顆粒購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科，每100 g生藥相當于濃縮顆粒劑8.44 g。溶解于60 ℃雙蒸水中，配成終濃度為0.281 g/mL的中藥溶液，4 ℃密封保存。8只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為含藥血清組、空白血清組，每組4只，按照人臨床用量的等效劑量和動物體表面積[6]計算，含藥血清組以0.9 g/kg濃度的腦泰方濃縮顆粒灌胃，每天灌胃2次，持續5 d，空白血清組大鼠予以2 mL生理鹽水灌胃。末次灌胃結束1.5 h后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，以3000 r/min（半徑13.5 cm）離心10 min，將同組大鼠血清進行混裝，水浴鍋56 ℃滅活30 min，然后過濾除菌，分裝，于-80 ℃超低溫冰箱內保存備用。

1.4? OGD/R PC12細胞損傷模型制備與分組給藥

采用1%雙抗+10%胎牛血清+89% DMEM的完全培養基培養PC12細胞，每2～3 d傳代一次，置于二氧化碳細胞培養箱中培養。取生長狀態良好的細胞，PBS洗細胞2遍，0.25%胰蛋白酶消化后，終止，離心，重懸，細胞計數，按2000個/孔接種至96孔細胞培養板中，繼續培養24 h后，待細胞密度為70%融合時進行OGD/R模型建立[7]，其中缺氧缺糖4 h，復氧18 h，以鏡下觀察細胞形態發生變化及細胞存活率（CCK8法）小于50%作為模型制備成功的評價指標。將細胞隨機分為正常組、模型組、抑制劑組（2 mmol/L的4-PBA）、腦泰方低濃度組（10%含藥血清）、腦泰方中濃度組（15%含藥血清）、腦泰方高濃度組（20%含藥血清）6個組，各組在復氧的同時加入相應濃度的藥物或等量培養基處理，繼續培養18 h，用于后續實驗。

1.5? CCK8法檢測細胞活力

取生長狀態良好的PC12細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2000個細胞接種于96孔細胞培養板，后續造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內液體，然后加入完全培養基200 μL，同時每孔加入20 μL的CCK8溶液，于細胞培養箱中繼續培養3～4 h，最后用酶標儀于450 nm波長下測定各孔光密度（optical density， OD）值，并計算各組藥物的細胞存活率。

1.6? 細胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）活性檢測

按上述方法造模并分組給藥培養后，收集各組細胞上清液，以1500 r/min（半徑13.5 cm）離心15 min，嚴格參照試劑盒說明書，采用LDH試劑盒檢測各組LDH活性，主要步驟嚴格參照試劑盒說明書。

LDH活性（U/L）=（測定OD值-對照OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度×稀釋倍數×1000。

1.7? Hoechst 33258染色觀察細胞核形態改變

取生長狀態良好的PC12細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調整細胞密度，按每孔2000個細胞接種于黑色96孔細胞培養板，靜置培養24 h，后續造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內液體，PBS洗2次，加入Hoechst 33258工作液，室溫避光孵育15 min，PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.8? Tunel染色檢測細胞凋亡率

取生長狀態良好的PC12細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，調整細胞密度，按每孔10 000個細胞接種于黑色24孔細胞培養板，靜置培養24 h，后續造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內液體，PBS洗2次，經4%多聚甲醛固定30 min、0.25% Triton X-100處理10 min及3% H₂O₂作用2 min后，PBS洗3次；加入預先配制的Tunel反應混合液（50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP），37 ℃濕盒避光孵育1 h，棄掉孔內液體，PBS洗3次；加入DAPI工作液（1∶800），室溫避光孵育15 min，PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，隨機選取5個視野，根據凋亡陽性細胞數/DAPI陽性細胞數的比值計算細胞凋亡率。

1.9? 免疫熒光法檢測細胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達

取生長狀態良好的PC12細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔2000個細胞接種于96孔細胞培養板，后續造模與給藥步驟同“1.4”。棄掉孔內液體，PBS洗2次，經4%多聚甲醛固定30 min、0.25% TritonX-100處理15 min及5% BSA封閉30 min后，PBS洗3次；加入兔抗大鼠Beclin-1、LC3-A、LC3-B、GRP78、CHOP或PERK一抗工作液（1∶100或1∶200），4 ℃避光孵育過夜，棄掉孔內液體，PBS洗5次；加入FITC標記的山羊抗兔二抗工作液（1∶400），37 ℃避光孵育30 min，棄掉孔內液體，PBS洗4次；加入DAPI工作液（1∶800），室溫避光孵育15 min，PBS洗3次，最后于激光共聚焦顯微鏡下進行熒光檢測。

1.10? Western blot檢測細胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達

PC12細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔50 000個細胞接種于6孔細胞培養板，靜置培養24 h，后續造模及分組給藥同“1.4”。加入含1%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA細胞裂解液，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min（半徑13.5 cm）離心15 min，取上清，-80 ℃冰箱內保存、備用。BCA法蛋白定量。適量蛋白樣品進行電泳分離，5%濃縮膠60 V，10%分離膠90 V；然后濕轉90 min，電流300 mA，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗（1∶1000），4 ℃搖床過夜。次日，TBST漂洗3次，二抗（1∶5000）室溫孵育60 min，TBST漂洗3次，添加ECL發光液暗室曝片。用ImageJv1.8.0軟件分析各條帶灰度值，統計各組與β-actin灰度值的比值。

1.11? 統計學方法

使用SPSS 23.0統計軟件進行數據處理。實驗數據均以“ｘ±s”表示，組間數據比較采用ANOVA方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett's T3作組間多重比較。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組PC12細胞存活率及LDH活性

與正常組比較，模型組LDH活性明顯升高（P＜0.01），細胞存活率明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組LDH活性明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），細胞存活率明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖1。

2.2? 各組PC12細胞核形態改變

模型組細胞凋亡數明顯增加，凋亡細胞核聚集，染色質濃染，呈馬蹄形或月牙狀的典型凋亡特征；抑制劑組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組均能顯著抑制PC12細胞凋亡，染色質濃染、細胞核固縮現象減輕，凋亡細胞數明顯減少，提示其能有效抑制OGD/R造模損傷后的PC12細胞凋亡，并改善細胞凋亡狀態。詳見圖2。

2.3? 各組PC12細胞凋亡率比較

與正常組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組、腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖3—4。

2.4? 各組PC12細胞Beclin-1、LC3、GRP78、CHOP、PERK蛋白表達情況

與正常組比較，模型組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達明顯升高（P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，腦泰方中濃度組、腦泰方高濃度組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；抑制劑組GRP78、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；腦泰方低濃度組LC3Ⅱ蛋白表達明顯降低（P＜0.05），LC3Ⅰ蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。詳見圖5—6。

2.5? 各組PC12細胞內GRP78、PERK、CHOP、LC3、Beclin-1蛋白相對表達情況

與正常組比較，模型組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平明顯升高（P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白相對表達水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組和腦泰方高濃度組GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），LC3Ⅰ蛋白表達量明顯升高（P＜0.01）；腦泰方中濃度組PERK、CHOP、LC3Ⅱ蛋白相對表達水平明顯降低（P＜0.05），LC3Ⅰ蛋白相對表達水平明顯升高（P＜0.01）。詳見圖7—8。

3 討論

IS可歸屬于中醫學“中風”“仆擊”“偏枯”等疾病范疇。素體氣血虧虛，正氣漸衰，或情志飲食失調、長期勞逸失度等導致機體陰陽失調，臟腑功能紊亂，氣血運行失常，后由風、火、痰、瘀、虛五端相互交作引觸，遂發中風[8]。清代名醫王清任在《醫林改錯》中提出中風之氣虛血瘀理論，認為中風是由于元氣虧虛導致血液運行不暢而為瘀，強調在治療中風時須補氣藥與活血藥合用，并創益氣活血之代表方“補陽還五湯”，為后世醫家治療中風提供了新的方向[9]。腦泰方正是根據中風之氣虛血瘀理論創制，由黃芪、川芎、地龍、僵蠶4味藥組成，方中重用黃芪為君，取其補氣以行氣、補氣以養血活血之意；川芎“血中之氣藥”為臣，可活血行氣，祛內外之邪風；地龍性善走竄，長于通絡，與黃芪、川芎之品合用，大大增強行氣活血通絡之功效；僵蠶長于祛外風、息內風，還可化痰散結，具有祛風化痰通絡之功效。全方藥簡而力宏，共奏補氣活血、化瘀通絡之功效。腦泰方是葛金文教授課題組研發的專利處方（專利號：ZL201110178359.4），臨床試驗表明腦泰方對于腦卒中氣虛血瘀證患者具有良好的臨床效果，目前已成熟運用于臨床[10]。課題組前期實驗研究發現，腦泰方可有效抑制CIRI大鼠病灶內神經細胞的凋亡，調控神經細胞內鐵死亡，減少鐵沉積，促進神經功能恢復；腦泰方含藥血清對血紅蛋白刺激的大鼠皮質神經元細胞也表現出明顯的保護作用，其機制可能與增強SOD酶、GPX4等抗氧化因子的活性，進而提高神經細胞抗氧化能力有關[11-14]。

ER是細胞質內重要的細胞器，主要參與蛋白質的合成、加工與修飾，大多數膜脂的合成、細胞內重要信號物質Ga2+的儲存以及重要激素的合成等多種生理活動與ER關系同樣密切[15]。當CIRI引起腦組織損傷時，神經細胞內ER平衡狀態被打破，大量未折疊/錯誤折疊的蛋白在ER囊腔內蓄積，引發ERS，進一步代償性激活UPR，減少蛋白質的合成，清除未折疊/錯誤折疊蛋白以緩解ERS狀態[16]，但是當ERS時間及強度超過UPR承載范圍后，則會激活下游凋亡信號通路，促使細胞發生凋亡。GRP78是ERS發生的標志性效應蛋白，在正常生理狀態下，GRP78主要與ER的應激下游受體PERK、ATF6和IRE1相結合，以保持它們處于失活狀態，當ERS發生時，GRP78則與之發生解離，導致GRP78含量增加。羅書萍等[17]研究發現，CIRI模型組大鼠腦內缺血半暗帶區GRP78 mRMA表達明顯增加，并且隨著灌注時間的延長不斷增加，在12 h達到高峰，24 h后表達才開始減少。PERK是ER中重要的跨膜感受蛋白之一，在過度ERS狀態下，GRP78與PERK解離，PERK通過同源二聚化或自身磷酸化而自我激活，最終激活CHOP基因轉錄，從而進一步介導細胞凋亡[18]。細胞自噬與凋亡關系非常密切且復雜，自噬可以增強或抑制凋亡的發生，這主要取決于刺激強度和時間，而凋亡相關信號通路的某些部分又可與自噬蛋白相互作用而影響自噬的發生[19]。Beclin-1蛋白是細胞自噬過程中重要的調節蛋白，同時對細胞凋亡也起著至關重要的作用[20]。呂棟輝等[21]研究發現，CIRI大鼠LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表達明顯增加，經過藥物干預之后，其表達均明顯下降，其機制可能是通過干預CIRI的神經細胞自噬發揮神經保護作用。LC3Ⅱ是檢測細胞自噬發生的標志蛋白，LC3前體合成后，通過自噬相關蛋白4水解形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ繼續被其他自噬相關蛋白片段激活與磷脂酰乙醇胺共價結合形成LC3Ⅱ，最后被轉移結合至自噬體膜上，而LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高則說明細胞的自噬活性增強[22-23]。

本研究采用OGD/R PC12細胞是目前最理想的體外模擬CIRI損傷的模型[24-25]。此次研究結果顯示，模型組細胞內LDH活性增加，細胞凋亡率增加，存活率下降，GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達增加，LC3Ⅰ蛋白表達減少，提示經過OGD/R損傷的PC12細胞發生明顯凋亡，其機制可能與ERS導致細胞發生凋亡有關，與前人研究結果一致[26]。進一步研究發現，腦泰方含藥血清可降低OGD/R損傷的PC12細胞內LDH活性，降低細胞凋亡率，負向調控GRP78、PERK、CHOP、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達，且15%及20%濃度的腦泰方含藥血清效果可能更優，表明腦泰方可有效緩解受損神經細胞ERS導致的過度自噬狀態，進而抑制細胞凋亡，發揮神經保護作用。

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