低氧運動預適應激活自噬調控Hippo/YAP/TAZ信號通路減輕急性低氧力竭運動大鼠骨骼肌損傷

孔海軍　諶曉安

摘 要：目的：探討低氧運動預適應激活自噬調控Hippo/YAP/TAZ信號通路對急性低氧力竭運動大鼠骨骼肌保護的機制。方法：50只6周齡SPF級雄性SD大鼠，隨機分為空白對照組（Con組，n=10）、單純急性低氧力竭運動組（HE組，n=10）、低氧預適應+急性低氧力竭運動組（HP+HE組，n=10）、運動預適應+急性低氧力竭運動組（EP+HE組，n=10）、低氧預適應+運動預適應+急性低氧力竭運動組（EP/HP+HE組，n=10）。預適應周期2 w，EP+HE組及EP/HP+HE組進行2次/d常壓常氧跑臺訓練；HP+HE組及EP/HP+HE組進行10 h/d間歇性低氧暴露（FiO2 13.5％）。預適應后HE組、HP+HE組、EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進行低氧環境跑臺力竭訓練（FiO2 ?11.9％～12.0％）。低氧力竭運動后2 h，尾靜脈取血檢測血清骨骼肌損傷、炎癥反應和氧化應激指標，蘇木精-伊紅染色觀察腓腸肌病理特征，并檢測腓腸肌自噬相關蛋白、Hippo/YAP/TAZ信號通路蛋白及mRNA。結果：（1）與HE組比較，預適應組大鼠低氧力竭運動后的腓腸肌結構損傷、炎癥反應和氧化應激明顯減輕。（2）HE組Atg5、Beclin1蛋白表達顯著低于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP/HP+HE組Atg5、Beclin1蛋白表達顯著高于HP+HE組（P<0.05）；HE組LC3-Ⅱ蛋白表達顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。（3）HE組MST1 mRNA顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）；HE組LATS1 mRNA顯著低于預適應組（P<0.05）；HE組YAP mRNA顯著高于預適應組（P<0.05），EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）；HE組及HP+HE TAZ mRNA顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組均顯著降低（P<0.05）。（4）HE組MST1、LATS1及其磷酸化水平顯著低于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05），EP/HP+HE組MST1顯著高于HP+HE組（P<0.05）；HE組YAP蛋白顯著高于EP+HE組及EP/HP+HE組（P<0.05）；HE組TAZ蛋白顯著高于預適應組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE組均顯著低于HP+HE組（P<0.05）。結論：低氧運動預適應可能通過激活骨骼肌自噬抑制Hippo/YAP/TAZ信號通路減輕急性低氧力竭運動大鼠的骨骼肌損傷、炎癥反應和氧化應激反應。

關鍵詞：低氧運動預適應；自噬；Hippo/YAP/TAZ信號通路；急性低氧力竭運動；骨骼肌損傷

中圖分類號：G804.2 文獻標識碼：A文章編號：1006-2076（2023）03-0089-10

Hypoxic Exercise Preconditioning Activates Autophagy to Regulate Hippo/YAP/TAZ Signaling Pathway to Alleviate Skeletal Muscle Injury in Acute Hypoxic Exhaustive Exercise Rats

KONG Haijun1，2，CHEN Xiaoan1

1.College of P.E.， Jishou University， Xiangxi 416000， Hunan， China; 2. College of P.E.， Kashgar University， Kashgar 844000， Xinjiang， China

Abstract：Objective：To explore the mechanism of hypoxic exercise preconditioning activating autophagy to regulate Hippo/YAP/TAZ signaling pathway to protect skeletal muscle in rats undergoing acute hypoxic exhaustive exercise. Methods： 50 six-week-old SPF male SD rats were randomly divided into blank control group （Con group， n=10）， simple acute hypoxic exhaustive exercise group （HE group， n=10）， hypoxic preconditioning+acute hypoxic exhaustive exercise group （HP+HE group， n=10）， exercise preconditioning+acute hypoxic exhaustive exercise group （EP+HE group， n=10）， hypoxic preconditioning+exercise preconditioning+acute hypoxic exhaustive exercise group （EP/HP+HE group， n=10）. The preconditioning period was 2 weeks， EP+HE group and the EP/HP+HE group were trained twice a day on the normal pressure and oxygen treadmill; HP+HE group and EP/HP+HE group were exposed to intermittent hypoxia with FiO2 13.5％ for 10 hours/day. On the next day after preconditioning， rats in HE group， HP+HE group， EP+HE group and EP/HP+HE group were trained to run on the treadmill in a hypoxic environment （FiO2 11.9％～12.0％）. Two hours after exercise， tail vein blood was taken to detect serum skeletal muscle injury， inflammatory reaction and oxidative stress indicators， gastrocnemius muscle tissue was taken for HE section staining and autophagy related protein， Hippo/YAP/TAZ signal pathway protein and mRNA were detected. Results： （1） Compared with HE group， the structural damage， inflammatory reaction and oxidative stress of gastrocnemius muscle of rats in preconditioning group were significantly reduced after hypoxic exhaustive exercise. （2） The expression of Atg5 and Beclin1 protein in HE group was significantly lower than that in EP+HE group and EP/HP+HE group（P<0.05）， and the expression of Atg5 and Beclin1 protein in EP/HP+HE group was significantly higher than that in HP+HE group （P<0.05）; The expression of LC3-Ⅱ protein in HE group was significantly higher than that in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）， and that in EP+HE group and EP/HP+HE group was significantly higher than that in HP+HE group （P<0.05）. （3） MST1 mRNA in HE group was significantly higher than that in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）， and that in EP+HE group and EP/HP+HE group was significantly higher than that in HP+HE group （P<0.05）; LATS1 mRNA in HE group was significantly lower than that in preconditioning group （P<0.05）; YAP mRNA in HE group was significantly higher than that in preconditioning group （P<0.05）， while that in EP/HP+HE group was significantly lower than that in HP+HE group （P<0.05）; The mRNA of HE group and HP+HE TAZ was significantly higher than that of EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）. （4） MST1， LATS1 and their phosphorylation levels in HE group were significantly lower than those in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）， and MST1 in EP/HP+HE group was significantly higher than those in HP+HE group （P<0.05）; YAP protein in HE group was significantly higher than that in EP+HE group and EP/HP+HE group （P<0.05）; TAZ protein in HE group was significantly higher than that in preconditioning group （P<0.05）， while that in EP/HP+HE group was significantly lower than that in HP+HE group （P<0.05）. Conclusion：Hypoxic exercise preconditioning may inhibit Hippo/YAP/TAZ signal pathway by activating skeletal muscle autophagy， thereby reducing skeletal muscle injury， inflammatory response and oxidative stress response in rats undergoing hypoxic exhaustive exercise.

Key words：hypoxic exercise preconditioning; autophagy; Hippo/YAP/TAZ signal path; acute hypoxic exhaustive exercise; skeletal muscle injury

急性高強度運動可能形成機械、代謝及氧化等多方面、復合性壓力，短時間過度載荷可能誘導機體炎癥反應、氧化應激，同時存在骨骼肌和內臟器官組織損傷風險［1］。人體及動物實驗證據表明［2］，急性高強度運動可誘導血清、骨骼肌、心肌等組織炎癥及骨骼肌損傷標記物水平激增。此外，低氧條件下的急性運動運動通過激活氧化應激會加劇骨骼肌承受的復合壓力［3］。有研究認為，模擬3 000 m海拔低氧環境75％～80％ HRmax強度力竭跑導致運動員血清骨骼肌損傷標志物激增，且參與對抗壓力源的蛋白表達水平急劇增加［4］。近年來的研究證實，運動可激活機體自噬途徑，從而提高組織細胞自調控能力及能量穩態［5］。自噬途徑激活可能參與急、慢性運動中骨骼肌功能整合過程，中等強度運動可導致機體自噬反應激活、骨骼肌自噬小體激增［6］。然而，迄今為止，高強度力竭訓練骨骼肌自噬反應特征及其機制并未得到充分驗證。有研究認為，低氧條件下急性運動可能導致骨骼肌自噬抑制，這可能與骨骼肌組織對低氧的“遲滯反應”或運動性氧化應激有關［7］。Hippo/YAP/TAZ信號通路在人類腫瘤發展、骨骼肌發育修復及肌衛星細胞功能調控過程中發揮重要作用，此外有證據顯示該通路與骨骼肌組織自噬存在交互作用。Hippo通路影響骨骼肌自噬通量，廣泛參與骨骼肌內組織穩態、氧化損傷及修復過程，且靶向Hippo/YAP/TAZ自噬軸參與調控YAP/TAZ轉錄活性［8］。研究證實，自噬機制扮演了YAP/TAZ的下游靶蛋白調節器，外源性自噬抑制劑干預或內源性敲除自噬相關基因（ATG5/7/10）可抑制YAP及TAZ介導的細胞增殖能力［9］。

大量研究顯示，中短期中、高強度運動可能誘發間歇性相對/絕對心肌缺血缺氧，從而增強心肌對缺血缺氧的耐受能力，定量適應運動誘導的組織保護作用稱為運動預處理（Exercise preconditioning，EP），EP可有效減輕高強度急性運動可能導致的心肌缺血缺氧損傷［10］。重復性暴露于低氧可使機體組織和細胞獲得對缺氧的高度耐受性，該現象稱為低氧預適應（Hypoxic preconditioning，HP）［11］。EP和HP對心肌、肺組織、腦組織的保護作用及機制已基本明了，但現階段缺乏對急性高強度運動中骨骼肌等高活性組織保護作用的研究。同時，EP和HP的作用效應存在趨同性，但其具體作用機制大相徑庭，現階段尚無證據闡明二者作用差異的分子學機制。自噬可能介導EP和HP的激活過程，但其機制仍存在較大爭議。多項研究證實，HP復氧階段通過下調Beclin1表達誘導自噬抑制現象，相反，外源性抑制自噬可能減弱EP誘導的組織細胞保護作用，表明自噬部分參與了EP和HP的組織細胞保護機制［12］。另有證據顯示，Hippo及其下行通路可能與低氧暴露骨骼肌損傷修復及組織保護密切相關［13］。基于上述結論，課題組假設Hippo/YAP/TAZ信號通路作為隱匿機制，通過將EP、HP誘導的間歇性骨骼肌缺血缺氧與自噬調控聯系起來，進而實現低氧力竭運動中骨骼肌的保護作用。因此，本研究擬針對低氧運動預適應大鼠低氧力竭運動后腓腸肌損傷、自噬水平及Hippo/YAP/TAZ信號通路表達進行分析，探究低氧運動預適應激活自噬調控Hippo/YAP/TAZ信號通路減輕急性低氧力竭運動大鼠骨骼肌損傷的基本機制，為運動員高原訓練、移居高原人群體育鍛煉及官兵高原駐訓提供理論依據及參考。

1 材料與方法

1.1 動物和主要儀器、試劑

50只6周齡SPF級雄性SD大鼠，體重170±10 g，購自新疆醫科大學醫學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（新）2016-0002。

主要儀器設備：常壓低氧發生設備（Hypoxic Tent System），大鼠實驗跑臺（BHW-PT/5s），全自動組織切片機（KH-Q330），顯微圖像分析系統（NGI-2000U），PCR擴增儀（Biometra），酶標儀（Bio-Rad），高速冷凍離心機（Eppendorf），EP凝膠成像系統（Alpha），電泳系統（Bio-Red），紫外分光光度計（Eppendorf）。

主要試劑：一氧化氮、丙二醛、超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶、白介素-6、白介素1β、腫瘤壞死因子-α試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒、Trizol總RNA抽提試劑、cDNA合成試劑盒、雙鏈cDNA合成試劑盒、dNTP Mixture、Taq PCR MasterMix均購自上海碧云天生物公司，cDNA引物Oligo購自上海生工公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Proteintech公司，自噬相關5同源物（Atg5）、自噬關鍵分子酵母Atg6同系物（Beclin1）、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、哺乳動物不育系20樣激酶1（MST1）、大腫瘤抑制因子1（LATS1）、Yes相關蛋白-1（YAP）及轉錄共激活因子PDZ結合基（TAZ）單克隆抗體抗體購自美國Proteintech公司，Anti-β-actin內參抗體、Mouse源二抗、Rabbit源二抗、6.6×8.5 cm PVDF膜均購自上海碧云天生物公司。

1.2 動物分組及干預方案

動物于實驗室條件適應性喂養3 d后，隨機分為5組，每組10只，分別為：空白對照組（Blank control group，Con組）、單純急性低氧力竭運動組（Hypoxic exercise group，HE組）、低氧預適應+急性低氧力竭運動組（Hypoxic preconditioning+Hypoxic exercise group，HP+HE組）、運動預適應+急性低氧力竭運動組（Exercise preconditioning +Hypoxic exercise group，EP+HE組）、低氧預適應+運動預適應+急性低氧力竭運動組（Hypoxic preconditioning+Exercise preconditioning+Hypoxic exercise group，EP/HP+HE組）。

預適應干預前HE組、EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進行跑臺運動適應性訓練，3 d，1次/d，15 min/次，10～12 m/min，坡度0°，運動環境為常壓常氧；HE組、HP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進行低氧環境適應性暴露，3 d，1次/d，60 min，FiO2 14.5％（海拔約3000 m），常壓環境。

低氧運動預適應周期為2 w。Con組及HE組大鼠保持正常飲食及活動，不參與預適應干預方案；EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進行跑臺訓練，2次/d，早晚各1次，30 min/次，15～20 m/min，勻速漸增坡度0°～5°，運動環境為常壓常氧；HP+HE組及EP/HP+HE組大鼠晚間22：00～次日晨8：00于低氧帳篷休息，FiO2 13.5％（約3 500 m海拔），常壓環境。低氧運動預適應結束次日，HE組、HP+HE組、EP+HE組及EP/HP+HE組大鼠進行低氧環境跑臺力竭訓練，FiO2 11.9％～12.0％（約4 500 m海拔），10～20 m/min遞增跑速至力竭，運動過程中采用聲、頻閃光及電流刺激。力竭判斷標準為：①大鼠呼吸短促，無力維持既定跑速；②后肢隨轉動皮帶后拖達30 s，經聲、頻閃光及電流刺激均無反應。

1.3 動物處置、取樣

低氧力竭訓練2 h后，麻醉、空腹狀態尾靜脈取血；迅速固定，取大鼠后肢腓腸肌，剔除筋膜及脂肪組織，生理鹽水反復漂洗，吸水紙擦干水分，經液氮急速低溫后轉移至-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.4 檢測方法

1.4.1 血清和腓腸肌組織勻漿制備

大鼠全血室溫自凝45 min，4℃、2 000 rpm離心10 min取上清即為血清；取500 mg腓腸肌組織，剪碎，加入PBS勻漿介質，2 000 r/min勻漿2 min，勻漿液轉移至離心管，4℃、6 000 r/min，離心10 min，取上清-80℃保存。

1.4.2 生化檢測

取預先制備血清，采用試劑盒檢測血清一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）及肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）水平。

1.4.3 酶聯免疫吸附實驗

取預先制備血清，按照試劑盒說明書稀釋標準品至10 μg/mL、加樣并設空白孔和待測樣品孔，37℃孵育20 min，甩干液體，PBST重復洗滌3次，待測樣品孔加入酶標試劑液，37℃孵育20 min，PBST重復洗滌3次，TMB底物顯色，加入終止液，450 nm處測OD值，濃度轉換，以此檢測白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）。

1.4.4 腓腸肌組織病理染色

取大鼠腓腸肌組織，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定24 h；梯度酒精（75％、85％、95％×2、100％×2）各脫水1 h，二甲苯透明，重復2次，各30 min；50℃～52℃浸蠟2次，各1 h；組織包埋，凝固后轉移至4℃冰箱保存。沿樣品橫截面切片，厚度8 μm，40℃水浴展片，60℃烤片過夜。二甲苯脫蠟3次，各10 min；梯度酒精（100％×2、95％×2、85％、75％）及蒸餾水各復水5 min。Harris蘇木素液浸染5 min，漂洗；1％鹽酸酒精脫色5 s，飽和磷酸氫二鈉溶液反藍10 min，70％、80％酒精各固定10 min；伊紅液染色30 s，烤干、封片；鏡下觀察，切片中心視野采集圖像。

1.4.5 RT-PCR

取200 μL腓腸肌勻漿液，采用Trizol法提取組織液總RNA，電泳檢測完整性，分光光度儀檢測RNA純度及濃度。使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測mRNA相對表達水平。PCR反應體系20 μL：cDNA模板1 μL、ddH2O 7 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、2×Taq PCR master mix10 μL，條件為95℃初始變性55 s；然后在95℃變性10 s，57℃退火30 s，40個循環。每組實驗重復3次。根據熔解曲線剔除異常數據，導入相對定量公式（2-ΔΔCt）逐個計算樣品基因的相對表達量，目標基因及其引物序列見表1。

1.4.6 蛋白印跡檢測

取200 μL腓腸肌勻漿液，采用RIPA法提取組織總蛋白，4℃，15 000 g離心20 min；取上清液使用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，95℃變性15 min。配置SDS-PAGE凝膠，濃縮膠恒壓80 V電泳30 min，分離膠恒壓110 V電泳至溴酚藍到達分離膠底部，20 μg上樣，用電轉法將蛋白質轉移到PVDF膜上。5％脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗（1[DK]∶1 000稀釋），4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜10 min×3次，加二抗（1[DK]∶3 000稀釋），37℃孵育40 min；TBST洗膜10 min×5次。ECL法顯影，凝膠成像系統成像后使用Quantity One3.0軟件分析，以β-actin作為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 25.0統計學軟件進行統計分析，數據以平均數±標準差（MEAN±SD）表示，兩樣本平均數間比較采用t檢驗分析，多樣本平均數間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）和兩因素方差分析（one way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清骨骼肌損傷標志物變化

本研究對各組大鼠血清骨骼肌損傷指標進行檢測，結果表明（見表2），與Con組比較，低氧力竭運動各組LDH和CK水平均顯著上升（P<0.05）。可見，HE組及預適應組大鼠均出現不同程度骨骼肌損傷。與HE組比較，預適應組血清LDH及CK水平均顯著下降（P<0.05）；預適應組間比較可知，EP/HP+HE組血清LDH顯著低于HP+HE組及EP+HE組（P<0.05）；EP+HE組血清LDH及CK低于HP+HE組，但比較并無統計學意義（P>0.05）。以上結果說明，急性低氧力竭運動導致大鼠骨骼肌損傷標志物水平激增，2 w低氧和/或運動預適應降低了低氧力竭后運動大鼠骨骼肌損傷。

2.2 各組大鼠血清炎癥因子變化

本研究檢測了各組大鼠血清炎癥標志物水平，結果表明（見表3），與Con組比較，低氧力竭運動各組血清IL-6、IL-1β及TNF-α均顯著上升（P<0.05）。就IL-6而言，與HE組比較，預適應組均顯著降低（P<0.05），預適應組內比較無統計學意義（P>0.05）；就IL-1β而言，與HE組比較，EP/HP+HE組顯著降低（P<0.05），HP+HE組及EP+HE組呈下降趨勢，但無統計學意義（P>0.05）；就TNF-α而言，與HE組比較，預適應組均顯著降低（P<0.05），EP+HE組及EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）。上述結果表明，急性低氧力竭運動導致大鼠血清炎癥標志物水平激增，2 w低氧和/或運動預適應降低了低氧力竭運動后大鼠炎癥水平。

2.3 各組大鼠血清氧化應激標志物變化

本研究檢測了各組大鼠血清氧化應激標志物水平，結果表明（見表4），與Con組比較，低氧力竭運動各組血清NO、MDA均顯著上升（P<0.05），血清SOD顯著下降（P<0.05）。就NO而言，與HE組比較，預適應組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE顯著低于HP+HE組及EP+HE組（P<0.05），可見低氧+運動預適應對血清NO的影響顯著效果高于單一預適應；就MDA而言，與HE組比較，預適應組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組及EP+HE組（P<0.05），EP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）；就SOD而言，與HE組比較，預適應組均顯著上升（P<0.05），EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。上述結果表明，急性低氧力竭運動導致大鼠血清氧化應激標志物水平明顯波動，2 w低氧和/或運動預適應降低了低氧力竭運動后大鼠氧化應激水平，低氧+運動預適應對低氧力竭運動后大鼠血清氧化應激標志物的影響可能好于單一預適應。

2.4 各組大鼠腓腸肌組織微細結構病理變化

Con組大鼠腓腸肌肌纖維結構正常，呈多邊形，排列有序，細胞核分布于肌細胞邊緣，顏色、邊界及形態均正常；HE組肌纖維腫脹、碎解，炎癥組織浸潤明顯，組織間隙散布不均，細胞排列混亂。預適應組較HE組肌纖維腫脹及炎癥組織浸潤減輕，細胞形態及邊界組織趨于正常。此外，預適應各組鏡下比較可知，EP+HE組、EP/HP+HE組肌纖維腫脹及炎癥組織浸潤癥狀減輕，肌細胞及組織邊界清晰（見圖1）。

2.5 各組大鼠腓腸肌自噬相關蛋白表達的變化

本研究對各組大鼠骨骼肌自噬相關蛋白Atg5、Beclin1及LC3-Ⅱ進行檢測，結果發現（見圖2），與Con組比較，低氧力竭運動組大鼠腓腸肌Atg5及Beclin1蛋白呈下降趨勢，LC3-Ⅱ蛋白呈上升趨勢。就Atg5蛋白表達而言，與Con組比較，低氧力竭運動各組均顯著下降（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就Beclin1蛋白表達而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就LC3-Ⅱ蛋白表達而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著上升（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著降低（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。上述結果表明，急性低氧力竭運動導致大鼠腓腸肌組織自噬水平被抑制，2 w低氧和/或運動預適應提高了低氧力竭運動后大鼠腓腸肌自噬水平，低氧+運動預適應對低氧力竭運動后大鼠腓腸肌自噬的影響可能好于單一預適應。

2.6 各組大鼠腓腸肌Hippo/YAP/TAZ信號通路相關mRNA表達的變化

本研究檢測了各組大鼠腓腸肌MST1、LAST1、YAP及TAZ mRNA水平，結果發現（見圖3），與Con組比較，低氧力竭運動組MST1、LATS1 mRNA顯著降低（P<0.05），YAP及TAZ mRNA顯著上升（P<0.05）。就MST1 mRNA表達而言，與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就LATS1蛋白表達而言，與HE組比較，預適應組均顯著上升（P<0.05）。就YAP蛋白表達而言，與HE組比較預適應組均顯著降低（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著低于HP+HE組（P<0.05）。就TAZ蛋白表達而言，與HE組及HP+HE比較，EP+HE組及EP/HP+HE組均顯著降低（P<0.05）。上述結果表明，急性低氧力竭運動抑制大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1 mRNA表達，同時上調YAP及TAZ mRNA表達；2 w低氧和/或運動預適應提高了低氧力竭運動后大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1 水平并下調YAP、TAZ mRNA表達。

2.7 各組大鼠腓腸肌Hippo/YAP/TAZ信號通路相關蛋白表達變化

本研究對各組大鼠骨骼肌Hippo/YAP/TAZ信號通路蛋白MST1、LATS1、YAP及TAZ進行檢測，結果發現（見圖4），與Con組比較，低氧力竭運動組MST1、LATS1蛋白及其磷酸化呈下降趨勢，YAP及TAZ蛋白呈上升趨勢。就MST1蛋白表達而言，與Con組比較，HE組、HP+PE組及EP+HP組均顯著下降（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就p-MST1蛋白表達而言，與Con組比較，低氧力竭運動組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就LATS1蛋白表達而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，預適應組均顯著上升（P<0.05）；EP+HE組及[CM（23]EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就p-LATS1蛋白表達而言，與Con組比較，HE組及HP+HE組顯著降低（P<0.05）；與HE組比較，預適應組均顯著上升（P<0.05）；EP/HP+HE組顯著高于HP+HE組（P<0.05）。就YAP蛋白表達而言，與Con組比較，低氧力竭運動組均顯著上升（P<0.05）；與HE組比較，EP+HE組及EP/HP+HE組均顯著降低（P<0.05）。就TAZ蛋白表達而言，與Con組比較，HE組、HP+HE組及EP+HE組均顯著上升（P<0.05）；與HE組比較，預適應組均顯著降低（P<0.05），EP/HP+HE組均顯著低于HP+HE組（P<0.05）。上述結果表明，急性低氧力竭運動抑制大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平，同時導致 Hippo/YAP/TAZ通路下游蛋白YAP、TAZ表達上升；2 w低氧和/或運動預適應提高了低氧力竭運動后大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平并下調YAP、TAZ蛋白表達。

3 討 論

3.1 EP+HP對骨骼肌損傷、炎癥反應和氧化應激的影響

研究證實，急性劇烈運動導致機體廣泛炎癥反應、氧化應激和骨骼肌損傷，低氧環境可能進一步強化機體的應激反應［14］。IL-6是免疫級聯中重要的基礎免疫因子，大強度急性運動后，肌肉細胞產生的IL-1β可能通過誘導蛋白質降解參與肌肉適應調控，IL-6刺激中性粒細胞脫顆粒及皮質醇生成。TNF-α可由嗜中性粒細胞、活化的淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞、LAK細胞、星形膠質細胞、平滑肌細胞和部分轉化細胞產生，TNF-α以分泌的可溶形式和膜錨定形式存在，短時間高強度運動可刺激IL-6、TNF-α及IL-1β大量分泌［15］。王成美等認為［16］，單次大強度運動可導致機體血清TNF-α、IL-6激增。Dufaux等［17］亦證實，2～5 h跑測驗和5 km賽跑后均可見血清TNF-α、IL-1β升高。血清CK、LDH是骨骼肌損傷的早期標志物，廣泛存在于體內組織器官及血清，對運動應激反應敏感度較高，在高強度運動后參與誘導骨骼肌損傷。此外，為進一步探究低氧高強度運動對骨骼肌損傷、炎癥反應和氧化應激的影響，本研究設置了氧濃度11.9％～12.0％（約4 500 m海拔）環境的力竭跑臺訓練，結果發現，低氧力竭運動后大鼠腓腸肌結構損傷、炎癥反應和氧化應激反應與單純力竭訓練相似，且低氧環境加劇了大鼠腓腸肌結構損傷、炎癥反應和氧化應激現象。此外本研究亦發現，2 w EP或HP明顯減輕了大鼠低氧力竭運動后的腓腸肌結構損傷、炎癥反應和氧化應激現象，且EP+HP對骨骼肌損傷的預防作用可能優于單純HP或EP。以往的研究認為，在組織細胞保護效應上，EP與HP都可誘導機體產生內源性保護效應，且EP誘導機體產生的內源性保護效應與HP相似，HP和EP干預可能分別改善機體低氧耐受及骨骼肌性能［18］。但上述機制并非互相獨立，機體對低氧條件的短期適應可能形成通氣能力上升、骨骼肌微血管增生、骨骼肌代謝底物增加、低氧緩沖能力改善等優勢，運動預適應也可能獲得類似適應現象。因此，EP+HP可能形成骨骼肌缺氧、機械負荷的累積效應，在早期的低氧運動訓練中，EP+HP功能性適應的保護效應增強，機體產生結構性適應并改善骨骼肌耐低氧、耐負荷能力，從而減輕急性低氧力竭運動后骨骼肌損傷、炎癥反應和氧化應激癥狀。對于EP和HP的保護目標而言，現有的研究集中于心肌、肺、腦、腎、腸粘膜等器官組織，極少有研究涉及骨骼肌保護效應，本研究表明，單純或復合形式的2 w EP和HP可以作為避免急性低氧高強度訓練骨骼肌損傷及炎癥、氧化應激反應的措施，但EP和HP配合干預的周期、強度、頻率、形式等因素仍不明確，有賴于進一步實驗證實。

3.2 EP+HP對骨骼肌自噬蛋白的影響

低氧是誘導細胞氧化應激反應的強刺激劑，同時也是激活骨骼肌自噬的重要外源性因素。骨骼肌自噬可清除受損線粒體，同時抑制線粒體產生ROS，維持細胞內穩態，有研究證實自噬可能參與EP或HP組織器官的適應過程［19］。Atg5、Beclin-1和LC3-Ⅱ是機體自噬與凋亡過程的重要信號分子，Atg5參與介導自噬體的形成，而Beclin-1通過組成PtdIns3KC3復合體誘導細胞自噬，Atg5可能介導了LC3-Ⅱ和Beclin-1激活所誘發的細胞凋亡過程［20］。因此，本研究以骨骼肌自噬為切入點，探討EP+HP大鼠腓腸肌自噬的變化規律。自噬是一種溶酶體依賴性降解過程，在細胞能量平衡和細胞器更新中發揮重要作用。研究證實，自噬可能通過禁食、缺血/再灌注（I/R）、低氧暴露或運動等方式激活［21］。LIU等發現，晚期EP可通過激活自噬減輕力竭性運動誘導的心肌損傷［22］，HUANG等亦證實EP上調Beclin1表達并誘導自噬形成早期心肌保護效應［23］。有研究顯示，長期低氧運動導致自噬效應增強進而發揮組織保護效應。本研究結果表明，低氧力竭運動組導致運動后大鼠腓腸肌Atg5、Beclin1表達降低并上調了LC3-Ⅱ蛋白表達。研究認為，高強度運動后12 h內骨骼肌自噬體可能存在抑制期，可能與骨骼肌微管丟失有關［24］，該結果基本佐證了本研究結論。前期研究顯示，急性高強度運動誘導的氧化應激和ATP耗竭可能導致骨骼肌組織Beclin1表達上調，Beclin1-Bcl-2復合體裂解是誘導自噬的關鍵機制［25］。低氧條件下力竭訓練骨骼肌總負載量過高，可能抑制Beclin1-Bcl-2復合體裂解并降低Beclin1表達。此外，本研究結果顯示，與HE組比較，預適應組大鼠低氧力竭運動后腓腸肌Atg5、Beclin1表達上升，LC3-Ⅱ蛋白表達下降，因此，EP、HP或其累積結果導致自噬活動增強。據報道，Beclin1及其激活物Atg5的上調與AMPK、PI3K、ULK1和mTOR的上游介導有關，這些標志物先前已被證明參與EP和HP誘導的組織保護作用［26］。EP、HP誘導的自噬效應促進Beclin1-Bcl-2復合物裂解，Beclin1蛋白表達上升，I/R或單純低氧暴露也表現出類似結果［27］。本研究中大鼠腓腸肌自噬蛋白Atg5、LC3-Ⅱ和Baclin1的變化情況表明，EP、HP可代償性上調自噬通量水平，進而發揮其降解氧化損傷蛋白、ROS和衰老細胞器等亞細胞組件的功效，進而減輕低氧力竭運動后骨骼肌損傷、炎癥和氧化應激反應。

3.3 EP+HP對骨骼肌Hippo/YAP/TAZ信號通路的影響

現有研究證據表明，Hippo/YAP/TAZ通路是一條重要的細胞內信號通路，與廣泛的生理事件有關，包括細胞增殖、遷移及自噬的調節［28］。在哺乳動物中，Hippo信號通路的主要功能是抑制轉錄調節因子YAP和TAZ的活性，其核心組成元件為MST1和LATS1［29］。運動可以通過改變靶向基因的表達激活Hippo/YAP/TAZ通路，同時該通路的激活程度受運動負荷量的影響，如，有研究顯示，EP可導致小鼠血管內皮生長因子、JG12和Bcl-2蛋白表達顯著增加，Bax、Caspase 3、IL-6和衰老細胞的表達降低，導致MST1及其下游信號分子LAST1上調，進而下調YAP及TAZ表達［30］。另有研究證實，高強度運動訓練尤其是高強度急性運動可能導致Hippo/YAP/TAZ通路抑制現象［31］。研究表明，YAP和TAZ活性通過上游調節器MST1、LATS1負反饋轉錄機制控制［32］。動物實驗證實，急性力竭運動和短期低氧暴露（12.5％，48 h）可誘導骨骼肌YAP、TAZ表達上調，這表明骨骼肌在高強度運動負荷作用下出現降解效應［33］。此外，Duchenne肌營養不良mdx模型小鼠腓腸肌總YAP、TAZ及其磷酸化水平也呈上升趨勢，因此運動、低氧或異常骨骼肌肥大均導致骨骼肌MST1、LAST1蛋白及其下游標志物YAP、TAZ表達異常［34］。該結果佐證了本研究中低氧力竭訓練大鼠腓腸肌Hippo/YAP/TAZ通路標志物變化特征。上述結論與本研究結果基本一致，急性低氧力竭運動抑制大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平，同時導致下游蛋白YAP、TAZ表達上升。

本研究發現，EP、HP提高了低氧力竭運動后大鼠腓腸肌組織MST1、LAST1蛋白及磷酸化水平并下調YAP、TAZ蛋白表達。現階段研究證實，Hippo信號通路可能參與介導AKT/AMPK/mTOR級聯反應，Hippo激酶MST1可結合并抑制Akt1表達活性，Akt也可反向激活MST1磷酸化，表明Akt1和MST1存在雙向調節機制［35］。此外，Hippo通路效應器YAP通過Pten靶向抑制磷酸酶Pten及mTOR表達［36］。總之，上述研究表明Hippo和mTOR介導的骨骼肌功能調節信號通過多種機制緊密耦合。AMPK在機體內扮演細胞能量代謝“調節器”角色，在氧化應激或極端條件下對細胞能量代謝的適應性調節發揮重要作用，mTOR信號通路是蛋白合成的主要通路，有學者猜測mTOR可能是調控骨骼肌內組織代謝的核心靶點［37］。EP+HP累積效應可能導致肌內AMP/ATP比值及LKB1活性紊亂，AMPK-TSC2信號級聯反應激活，同時誘導mTOR活性上升，進而下調肌內YAP及TAZ表達。但目前的研究證據尚無法充分解釋Hippo/YAP/TAZ信號通路是否在規律性運動中發揮骨骼肌功能調控作用，但EP及HP可能通過AKT/AMPK/mTOR-Hippo/YAP/TAZ逆向調節發揮低氧力竭運動中骨骼肌整合作用。此外，多項研究證實，自噬激活現象抑制了YAP及TAZ表達［38］，本研究也發現了類似的現象。mTORC1信號是自噬途徑主要的上游抑制通路，而在TSC1缺失的細胞中，mTORC1通路則維持組成型激活狀態［39］。LIANG等研究表明，在敲除TSC1后，細胞自噬及Hippo通路下游物均顯著抑制［40］。有文獻報道，YAP及TAZ蛋白可以與自噬途徑的受體蛋白Beclin1交互影響，進而被Beclin1呈遞至自噬體內經由溶酶體降解［41］。因此，EP+HP可能通過激活骨骼肌自噬下調低氧力竭運動大鼠YAP、TAZ表達，并可能參與AKT/AMPK/mTOR級聯反應調控骨骼肌損傷、炎癥反應和氧化應激反應。

4 結 論

低氧和/或運動預適應可有效減輕急性低氧力竭運動導致的氧化應激、炎癥反應及骨骼肌損傷；低氧和/或運動預適應可通過激活自噬反應調控骨骼肌Hippo/YAP/TAZ信號通路并發揮急性低氧力竭運動中的骨骼肌保護機制。

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收稿日期：2022-11-04

基金項目：國家自然科學基金項目（編號：31660736）；新疆維吾爾自治區高校科技計劃項目（編號：XJEDU2021SY040）。

作者簡介：孔海軍（1992- ），男，山東濟寧人，博士研究生，講師，研究方向為運動生物化學。

通訊作者：諶曉安（1974- ），女，湖南張家界人，博士，教授，博士研究生導師，研究方向為運動人體科學。