基質金屬蛋白酶3基因多態性與新疆維吾爾族成人慢性牙周炎的相關研究

王婷婷 馬婷 單超 趙今

[摘要]目的：探討基質金屬蛋白酶3（Matrix metalloproteinase3，MMP-3）1171 5A/6A基因多態性與新疆維吾爾族成人慢性牙周炎的相關性。方法：從前期流行調查組獲取的墨玉縣樣本庫中隨機抽取300例頰黏膜拭子樣本（分為健康對照組、輕度組以及中重度組三組，每組100例），提取DNA并采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應檢測MMP-3 1171 5A/6A位點的基因型分布，使用卡方檢驗、Kruskal-Wallis H檢驗、Mann-Whitney U檢驗以及多分類Logistic回歸分析MMP-3 1171 5A/6A基因多態性與牙周炎易感性的相關性。結果：MMP-3 1171 5A/6A的5A6A和6A6A基因型分布在健康對照組與輕度組之間、健康對照組與中重度組間比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；5A6A等位基因分布健康對照組與輕度組間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。多分類Logistic回歸分析顯示，年齡＜35歲、5A/6A基因型及5A等位基因是慢性牙周炎的保護因素（P＜0.05）。結論：MMP-3 1171 5A/6A基因多態性可能與新疆墨玉縣維吾爾族人群慢性牙周炎相關，但仍需要更高質量的多中心研究進一步證實。

[關鍵詞]慢性牙周炎；基因多態性；基質金屬蛋白酶3；維吾爾族；Meta分析

[中圖分類號]R780.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）06-0104-04

Correlation of Matrix Metalloproteinase 3 Polymorphisms with Adults Chronic Periodontitis among Uyghur Adult in Xinjiang

WANG Tingting1，MA Ting1，SHAN Chao1，ZHAO Jin1，2

（1.Department of Dentistry and Endodontics，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China; 2.Research Institute of Dentistry of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the correlation between matrix metalloproteinase 3 1171 5A/6A polymorphisms and adult chronic periodontitis among Uyghur adults in Xinjiang. Methods? 300 buccal mucosal swab samples were randomly selected from the Moyu County sample base obtained from the previous epidemiological investigation group. DNA was extracted and polymerase chain reaction restricted fragment length polymorphism was used to detect the genotype distribution of MMP-3 1171 5A/6A. Chi-square test， Kruskal-Wallis H test， Mann-Whitney U test and multivariate Logistic regression were used to analyze the correlation between MMP-3 1171 polymorphism and periodontitis susceptibility. Results? The case-control study showed that there were significant differences in 5A6A and 6A6A genotype distribution between healthy controls and mild periodontitis and between mild periodontitis and moderate to severe periodontitis （P＜0.05）.There was also significant difference in allele frequency between healthy controls and mild periodontitis （P＜0.05）. Logistic analysis showed that age under 35 years old， 5A/6A genotype and 5A allele were the protective factors of chronic periodontitis （P＜0.05）. Conclusion? The polymorphism of MMP-3 1171 5A/6A may be related to chronic periodontitis among Uyghur adults in Moyu County of Xinjiang， but higher quality multi-center studies are still needed for further confirmation.

Key words： chronic periodontitis; polymorphism; matrix metalloproteinase 3; Uyghur nationality; Meta-analysis

慢性牙周炎（Chronic periodontitis，CP）是一種常見的多因素炎癥性疾病，主要病因仍然是細菌感染，可導致牙齦炎癥、牙槽骨喪失和牙齒脫落[1-2]。雖然致病微生物是疾病發生的觸發因素，但疾病進展在很大程度上依賴于宿主對細菌及其代謝產物的免疫反應[3]。在CP的發病機理中，復雜的細胞因子網絡參與了牙周組織的炎癥和免疫反應[4]，其中，基質金屬蛋白酶在牙周組織的重塑和破壞中發揮著核心作用。

MMP是一大類金屬依賴性細胞外蛋白酶[5]，負責重塑和降解細胞外基質[6-7]，包括膠原蛋白、彈性蛋白、明膠、基質糖蛋白和蛋白聚糖等[8]。MMP-3是MMP家族的關鍵成員，具有廣泛的底物特異性以及激活其他MMP的能力，其遺傳變異會影響其轉錄水平和蛋白質產生，從而影響MMP-3的產生與表達[9]。MMP-3基因位于11q22.3號染色體，在1 171位點處插入腺嘌呤核苷酸會導致MMP-3基因啟動子產生多態性，從而出現兩個等位基因，一個等位基因具有五個腺嘌呤核苷酸（5A），另一個具有六個腺苷（6A）[1，10]。已有研究表明，該啟動子基因多態性與MMP-3基因表達與調節有關，可能與CP的發病風險有關[9]。新疆墨玉縣是少數民族聚集地，主要由維吾爾族人群構成，該地區的CP的患病率高達65.2%，由于其具有獨特的文化、飲食習慣，使其CP的發生發展也具有獨特性[11-12]。目前，關于MMP-3基因多態性與CP易感性的研究較少，因此，本研究擬通過病例對照研究探索MMP-3基因多態性與墨玉縣維吾爾族人群CP易感性的關系，為該地區維吾爾族人群防治CP及制定治療策略提供遺傳學依據。

1? 材料和方法

1.1 研究對象：本課題流行病學調查小組前期于2013年3月-2013年4月通過隨機分層多階段的抽樣方法在新疆墨玉縣維吾爾族成年人群進行流行病學一般檢查及采集口腔頰黏膜拭子的工作，研究對象為隨機抽取頰黏膜拭子樣本庫中的300例樣本，分為輕度牙周炎組、中重度牙周炎組及健康對照組。輕度牙周炎組包含100例樣本，其中男57例，女43例，平均年齡為39.58歲；中重度牙周炎組包含100例樣本（中度牙周炎70例，重度牙周炎30例），其中男59例，女41例，平均年齡為52.92歲；健康對照組100例，男46例，女54例，平均年齡為29.95歲。本研究通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（20141201-08），三組研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準

1.2.1.1 CP組：①年齡18～65歲；②維吾爾族，且三代以上均未與其他民族通婚；③口腔內不得少于14顆牙，其中包括4顆磨牙；④無明顯的錯牙合畸形及不良修復體等局部刺激。

1.2.1.2 健康對照組：①年齡18～65歲；②維吾爾族，且三代以上均未與其他民族通婚；③口腔衛生狀況較好，牙齦正常或僅輕度炎癥，無附著喪失（Attachment loss，AL），無松動牙，缺失牙小于3顆。

1.2.2 排除標準：①患有糖尿病、高血壓及血液病等明顯影響牙周狀況的全身系統性疾病；②半年內進行全面牙周系統治療或3個月內使用抗生素或免疫抑制劑等藥物；③孕婦及全口無牙者。

1.3 CP診斷標準[13]：①輕度：牙齦有炎癥和探針出血，牙探診深度（Probing depth， PD）≤4 mm，AL為1～2 mm；②中度：PD≤6 mm，AL為3～4 mm；③重度：PD＞6 mm，AL≥5 mm。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取：用消毒剪刀將口腔頰黏膜拭子棉絮部分剝取至離心管，根據說明書，采用口腔拭子基因組DNA提取試劑盒（天根產品DP322）提取DNA，并保存至-20℃冰箱中。

1.4.2 PCR擴增：將提取的DNA進行PCR擴增，用于擴增MMP-3 1171 5A/6A基因的引物由上海生工公司合成，MMP-3 1171 5A/6A的引物及PCR反應體系正向引物為5-GGTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA，反向引物為5-CTTCCTGGAATTTCACATCACTGCCACCACT。PCR體系的總體積為25 μl，其中包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，正向引物1.5 μl，反向引物1.5 μl，DNA模板4 μl，無菌去離子水5.5 μl。將混合物混勻，離心機短暫離心3～5 s。PCR循環參數為94℃預變性5 min，94℃變性10 s，57℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃終延伸5 min。PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳分析證實PCR擴增成功。

1.4.3 酶切及基因多態性分析：用Tth111 I（寶日醫生物技術有限公司）對PCR擴增成功的產物進行酶切反應。MMP-3-1 171 5A/6A酶切體系總體積為20μl，其中包括PCR擴增產物7μl，Tth 111 I限制性內切酶1μl，10X Buffer R緩沖液2μl，無菌去離子10 μl，置65℃水浴1 h。將DNA Marker及MMP-3 1171 5A/6A的酶切產物在經核酸染料染色的2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳30～40 min。使用凝膠成像儀確定其基因分型。

1.5 質量控制：所有標本均在樣本庫中隨機抽取，樣本量足夠大，可減少抽樣誤差。用隨機數字表法隨機抽取10%樣本作重復性實驗，檢測位點MMP-3 1171 5A/6A PCR結果的可靠性。實驗標準化，使用定期校驗的同一型號的儀器，檢測方法統一，由經過訓練的同一人進行檢測，以控制檢出偏移，避免因研究者及研究儀器所造成的誤差。

1.6 統計學分析：采用SPSS 24.0軟件處理數據，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢查樣本具有群體代表性，采用直接計數法統計基因頻率及基因型數據，各基因型和等位基因頻率的差異比較采用卡方檢驗（α=0.05），并計算優勢比（Odds ratio，0R）及95%置信區間（95% confidence interval，95%CI）。多分類Logistic回歸模型分析MMP-3 1171 5A/6A位點基因型的危險因素。檢驗水準為雙側α=0.05，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 一般資料分析：研究共納入300例樣本，結果顯示，健康對照組、輕度牙周炎組及中重度牙周炎組年齡差異具有統計學意義（P＜0.05），說明隨著年齡的增長，牙周炎的程度可能會加重；三組AL比較差異也具有統計學意義（P＜0.05），提示牙周炎的程度越重，AL可能會越大；而性別在三組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 病例對照研究基因型檢測及統計分析：MMP-3 1171 5A/6A的基因型分為5A5A型純合子、5A6A型雜合子及6A6A型純合子，其PCR擴增產物全長129bp，6A等位基因無法被限制性內切酶Tth111 Ⅰ識別，5A等位基因因存在酶切位點而被分解為97bp和32bp，酶切后6A6A型純合子電泳顯示129bp一個條帶，5A6A型雜合子電泳顯示129bp、97bp、32bp三個條帶，5A5A型純合子顯示97bp、32bp兩個條帶。見圖1～2。

2.3 三組研究對象MMP-3 1171 5A/6A基因型及等位基因分布：三組研究對象的基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05）。MMP-3 1171 5A/6A的5A6A基因型分布在健康對照組與輕度組之間、健康對照組與中重度組之間的差異均具有統計學意義（P＜0.05），6A6A基因型分布在健康對照組與輕度組之間、健康對照組與中重度組之間的差異均具有統計學意義（P＜0.05），5A、6A等位基因分布在健康對照組與輕度組之間的差異具有統計學意義（P＜0.05），其余基因型及等位基因分布在三組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2～3。

2.4 病例對照研究的多因素Logistic回歸分析：為了剔除混雜因素的影響，把是否患有牙周炎（0=無，1=是）作為因變量，年齡小于35歲（0=否，1=是）、性別（0=女，1=男）、各位點基因型（0=純合野生型，1=雜合子，2=純合突變型），等位基因（0=祖源基因，1=突變基因）作為自變量，采取Logistic回歸分析方法，建立回歸模型，分析以上這些因素數量之間的變化關系。結果顯示年齡與CP的易感性相關，與年齡≥35歲相比，年齡＜35歲的人群的牙周炎易感性低（P＜0.05），提示年齡＜35歲是CP的保護因素，年齡越小越不容易患CP。以MMP-3的6A6A的基因型為參考對照，攜帶5A6A基因型的人群CP易感性低，5A6A基因型可能是CP的保護因子（P＜0.05），以6A等位基因為參考對照，5A等位基因是CP的獨立保護性因子（P＜0.05）。見表4。

3? 討論

MMP-3啟動子的基因多態性最早是在1995年由Ye等[14]提出的，但到目前為止，1171 5A/6A多態性對MMP3基因表達的影響的分子機制仍存在爭議。例如，在冠心病和心肌梗死患者中6A等位基因與較高的MMP-3水平相關[1]。Loo等[15]的研究發現，MMP-3 1171的基因多態性可能與CP的易感性有關，5A等位基因可能會降低中國人群罹患CP的風險。而本研究的病例對照研究結果顯示，MMP-3 1171位點的基因多態性在健康對照組與各CP組之間等位基因頻率及各基因型分布的差異具有統計學意義，并提示5A等位基因可能會減少新疆墨玉縣維吾爾族人群罹患CP的風險，這與Majumder等[16]對印度人群的研究結果相似。

結合本研究的研究結果，進一步探討基因多態性病例對照研究而產生互相矛盾的結果的原因如下：首先，不同人群或同一人群不同民族之間對同一疾病可能具有不同的發病風險。其次，先前的研究表明MMP-1 1G/2G和MMP-3 5A/6A多態性之間存在強烈的連鎖不平衡[17]，兩者之間的連鎖不平衡會影響相關基因的表達。再者，有研究表明MMP-3的mRNA的轉錄表達是由復雜機制調控的，不僅受到基因的調控，還受到細胞因子、生長因子等局部因素的影響[18]。除此之外，還有可能是因為方法學上的差異，例如樣本量大小、對照組的選擇及疾病診斷方法的不同造成的。

國內探索MMP-3 1171 5A/6A基因多態性與新疆墨玉縣維吾爾族人群CP易感性的研究比較少，本研究比較全面地探索了MMP-3基因多態性與新疆維吾爾族人群的CP易感性之間的相關性，并比較本研究與國內外研究的結果，并進一步探討基因多態性研究產生不同結果的原因。但是本研究也有一些局限性，Leite等[19]的研究發現，吸煙與CP的發病風險呈現顯著正相關，提示吸煙可能是影響牙周炎發病的重要危險因素，但是本次的病例對照研究并未統計維吾爾族人群的吸煙狀況，可能也會影響最后的實驗結果。此外，本次研究并未探索MMP-3與MMP-1之間的連鎖不平衡效應，從而可能忽略了這種效應對疾病易感性的作用。

綜上所述，MMP-3的基因多態性可能與新疆墨玉縣維吾爾人群CP的發病風險有相關性，但是仍需要進一步設計更優化的多中心研究，以更大的樣本量和更多的種族來研究MMP-3基因多態性與CP易感性之間的關聯，并在設計階段需要更加完善得考慮到連鎖不平衡及吸煙狀況等重要混合因素的影響。由于牙周炎本質上是多因素疾病，涉及基因、環境和生活方式之間的相互作用，因此，牙周病風險基因評估對于預防CP的發生和發展，診斷和治療策略可能是有一定價值的[20]。最后，希望在將來，使用多態性分析不僅能夠識別疾病中的個體差異，而且有助于評估人類對各種療法的反應。

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[收稿日期]2021-09-03

本文引用格式：王婷婷，馬婷，單超，等.基質金屬蛋白酶3基因多態性與新疆維吾爾族成人慢性牙周炎的相關研究[J].中國美容醫學，2023，32（6）：104-108.