芪仁通脈合劑中枳實的薄層色譜鑒別研究

趙娟娟 陸蕙蘭 葉侃倜 葉芷希 楊駿

（上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院 上海 200020）

芪仁通脈合劑是上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，處方由黃芪、燀桃仁、蜜麩炒枳實、當(dāng)歸、川芎、赤芍、地黃、牛膝、牡丹皮、炒地龍、桂枝、雞血藤和白茯苓等13 味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血，活血通絡(luò)的功效，臨床上主要用于治療動脈硬化，腦及冠狀動脈供血不足所致的冠心病、中風(fēng)、頭暈眼花、胸悶心悸、四肢麻木、靜脈曲張等癥。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有枳實的薄層鑒別及水分等常規(guī)檢查項目，但是通過長期實驗積累的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，以枳實對照藥材薄層色譜法鑒別枳實，在“枳實對照藥材”對應(yīng)斑點處，供試品顯色特別淡，實驗結(jié)果較不穩(wěn)定。通過文獻分析，枳實中的橙皮苷可作為指標(biāo)成分進行鑒別[1-5]，因此，為控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，本研究依據(jù)2020 版藥典的要求對芪仁通脈合劑原標(biāo)準(zhǔn)項下枳實的鑒別方法加以研究改進，建立新方法，達到薄層色譜法要求的快速、簡潔、明了的目的，從而為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ATS4 全自動點樣儀、Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；ST-40R 高速冷凍離心機、ST-40 高速離心機（賽默飛公司）；MS204TS/02 電子天平、XSE105DU 電子天平（梅特勒-托利多公司）；P120H超聲波清洗儀（德國Elma 公司）；TW20 恒溫水浴鍋（優(yōu)萊博公司）；KBF(E5.3)恒溫恒濕箱（Binder 公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥材

乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、無水甲酸（General-Reagent 公司）；三氯化鋁（麥克林公司）；薄層色譜硅膠預(yù)制板（煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所）；高效硅膠G 板（青島海洋化學(xué)工業(yè)研究所）；HPTLC silica gel 60 F254（德國Merck 公司）。

橙皮苷對照品、枳實（酸橙）對照藥材（中國食品藥品檢定研究院）；芪仁通脈合劑（上海寶龍藥業(yè)股份有限公司，批號2109001、2111001、2111002）；缺枳實陰性制劑（上海寶龍藥業(yè)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試品制備方法考察

1）供試品溶液 方法1：取芪仁通脈合劑（批號：2109001）10 mL，置于50 mL 離心管中，加二氯甲烷15 mL，振搖提取，離心（3 800 r/min，25 ℃），取上清液，再用乙酸乙酯萃取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液A；方法2：省略二氯甲烷提取，其余按方法1 制備供試品溶液B。

2）對照品溶液 取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作為對照品溶液。

3）對照藥材溶液 取枳實對照藥材0.1 g，同對照品溶液方法制成對照藥材溶液。

4）陰性溶液制備 取缺枳實陰性制劑10 mL，同供試品溶液方法制成陰性溶液。

1.3.2 不同展開劑、檢視方式及點樣量考察

吸取1.3.1 項下供試品溶液、橙皮苷對照品溶液以及陰性制劑溶液，分別將1、2、5 μL 點樣于同一高效硅膠G 薄層板上，分別置于展開系統(tǒng)一[乙酸乙酯-無水甲酸-水（10 ∶1 ∶1）]、展開系統(tǒng)二[三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液]、展開系統(tǒng)三[三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3 ∶8 ∶4 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液]中展層，結(jié)束后取出薄層板，晾干，先直接置于254 nm 或365 nm 紫外燈下檢視，然后再用2%三氯化鋁乙醇溶液噴霧后置于365 nm 紫外燈下檢視。

1.3.3 專屬性考察

考察3 批芪仁通脈合劑和1 批陰性制劑的薄層色譜行為。

1.3.4 不同薄層板、溫、濕度及放置時間考察

考察3 種不同來源的薄層板，不同溫度（10、20、30 ℃）、濕度（30%、50%、70%）以及供試品不同放置時間（0、24、48 h）對芪仁通脈合劑提取液薄層色譜行為的影響。

2 結(jié)果

2.1 供試品制備方法考察

供試品溶液A 和B 色譜在對照品相應(yīng)位置均可檢出相應(yīng)條帶，兩種供試品溶液的色譜行為基本一致，說明增加二氯甲烷萃取，僅能減少溶劑前沿部分的干擾，未對主斑點部分產(chǎn)生影響，因此選擇方法2，即直接乙酸乙酯萃取作為芪仁通脈合劑的供試品溶液的制備方法。

此外，通過供試品色譜、陰性色譜和對照藥材色譜（圖1）比較可知，對照藥材色譜傳遞到供試品色譜中僅有橙皮苷相應(yīng)的條帶，因此可以采用橙皮苷對照品進行芪仁通脈合劑中枳實的鑒別。

圖1 供試品制備方法考察

2.2 不同展開劑考察

3 個展開系統(tǒng)均能在對照品相應(yīng)位置檢出相應(yīng)條帶，且對照品比移值（retention factor, Rf）均在0.3～0.7 之間，供試品溶液色譜行為基本一致，但展開系統(tǒng)一和展開系統(tǒng)二供試品溶液中，在橙皮苷相應(yīng)色譜位置上方有一條條帶與之接近，容易重疊，進而影響鑒別；而展開系統(tǒng)三，各條帶分離度好，且陰性均無干擾，因此選擇展開系統(tǒng)三作為枳實鑒別的薄層色譜展開系統(tǒng)（圖1）。

2.3 不同檢視方式考察

顯色前，在紫外燈254 nm 下，橙皮苷對照品斑點不清晰，特征性不強，而且陰性色譜在對照品相應(yīng)位置有干擾條帶；在紫外燈365 nm 下，對照品色譜無熒光條帶，因此兩種條件下均無法鑒別枳實。而三氯化鋁乙醇顯色后，紫外燈365 nm 下，供試品色譜在對照品色譜相應(yīng)的位置上，均可檢出相同顏色的熒光條帶，且陰性無干擾，因此選擇顯色后的紫外燈365 nm 作為檢視方式。

2.4 供試品點樣量考察

不同點樣量供試品在橙皮苷對照品相應(yīng)位置均可檢出相同顏色的條帶，但點樣量為2 μL 時，供試品溶液中鑒別條帶顏色明顯，背景顏色較淺，易于鑒別，因此選擇供試品溶液的點樣體積為2 μL。

2.5 專屬性考察

3 批芪仁通脈合劑提取液和橙皮苷對照品均Rf 0.37處顯示相同顏色的熒光條帶，而陰性制劑無干擾，說明此方法專屬性強，可作為芪仁通脈合劑中枳實薄層鑒別方法（圖2）。

圖2 枳實的薄層色譜鑒別圖

2.6 不同薄層板、溫、濕度及供試品放置時間考察

在3 種不同來源薄層板，不同溫度和濕度以及供試品不同放置時間條件下，供試品色譜在與橙皮苷對照品色譜相應(yīng)位置上，均有相同顏色的斑點，分離度良好，且陰性無干擾，說明薄層板種類、溫度（10～30 ℃范圍內(nèi)）、濕度（30%～70%范圍內(nèi)）對芪仁通脈合劑的色譜行為影響較小，且供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 最佳枳實薄層條件

通過對上述實驗參數(shù)的考察，優(yōu)化后的薄層色譜條件為：取芪仁通脈合劑10 mL，置于50 mL 離心管中，用乙酸乙酯萃取兩次，每次15 mL，離心后合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作為對照品溶液。取缺枳實陰性制劑10 mL，同供試品溶液方法制成陰性溶液。吸取上述供試品溶液、陰性溶液各2 μL，對照品溶液10 μL，分別點于同一高效硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3 ∶8 ∶4 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，以2%三氯化鋁乙醇溶液噴霧，晾干后置紫外燈光（365 nm）下檢視。

3 討論

本研究對芪仁通脈合劑中枳實的薄層鑒別條件進行了考察和優(yōu)化。由于原枳實鑒別方法中，在“枳實對照藥材”對應(yīng)斑點處，供試品顯現(xiàn)斑點特別淡，實驗結(jié)果不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，通過查閱相關(guān)文獻[6]，本研究先是對原標(biāo)準(zhǔn)的展開系統(tǒng)進行了改進，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7.5 ∶2.5 ∶0.5）為展開劑展開，結(jié)果顯示陰性溶液存在干擾，因此該鑒別方法不可行。研究表明，黃酮類化合物是枳實的主要藥效成分，約占總含量的20%，主要包括橙皮苷等[1-2]，目前已有大量文獻采用橙皮苷作為枳實的定性和定量檢測指標(biāo)[3-5]，因此本研究考慮采用橙皮苷作為芪仁通脈合劑中枳實的薄層鑒別指標(biāo)成分。

在對芪仁通脈合劑供試品制備時，還考察了其他制備方法，如用石油醚、乙醚萃取，或用氨水調(diào)樣品pH 等，結(jié)果均因陰性對照干擾、橙皮苷對照品顯色不清晰，以及供試品色譜的相應(yīng)位置未檢出對照品的特征斑點等原因而無法進行定性鑒別。

枳實是芪仁通脈合劑的臣藥，在該方中起到活血祛瘀的功效，因此對其進行定性鑒別，可在一定程度上反映制劑的質(zhì)量。但中藥成方制劑通常由多味藥組成，其藥效是多種活性物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，若只對單味藥或單一成分進行檢測，難以全面控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量[7]。因此，本研究后續(xù)應(yīng)考慮增加枳實的含量測定指標(biāo)，以及君藥黃芪、臣藥燀桃仁、川芎等其他藥味的定性和定量鑒別指標(biāo)，從而能更好地控制制劑的質(zhì)量。