人臍帶間充質干細胞治療妊娠期糖尿病小鼠的機制研究

摘 要：本研究旨在探索人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）對妊娠期糖尿病（GDM）模型小鼠血糖控制的有效性及其作用機制，為治療GDM研究新的方法。研究采用組織塊培養法獲得hUCMSCs，使用D12451高脂飼料飼養雌性小鼠后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液誘導2型糖尿病，再將2型糖尿病的小鼠雄雌合籠過夜，次日早上以陰栓及鏡檢精子記為妊娠第1天，妊娠第4天測空腹血糖。空腹血糖濃度gt;11.2 mmol/L，并出現多飲、多食、多尿者定為GDM模型小鼠。通過尾靜脈注射5×105個hUCMSCs治療GDM模型小鼠，檢測血糖、血清炎癥因子、巨噬細胞、胰島病理切片等指標的變化來分析hUCMSCs對GDM小鼠的作用。結果發現：經hUCMSCs治療的GDM模型小鼠的血糖水平顯著降低（0.001lt;Plt;0.01）；免疫組化結果顯示，hUCMSCs治療后小鼠胰島β細胞相對α細胞比率顯著上升（0.001lt;Plt;0.01）；炎癥因子檢測結果顯示，hUCMSCs治療后促炎因子白介素-1β（IL-1β）的表達降低（Plt;0.05）；體外細胞試驗顯示，與hUCMSCs共培養的小鼠腹腔巨噬細胞M1型巨噬細胞表達增加。本研究表明，hUCMSCs治療能在一定程度上降低GDM小鼠的血糖水平，并有效影響其免疫調節作用，對于治療小鼠GDM有積極的作用。

關鍵詞：人臍帶間充質干細胞；妊娠期糖尿病；炎癥因子；糖代謝；模型小鼠

中圖分類號：R363；R587.1" " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2024.03.006

Mechanism Study of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Mice with Gestational Diabetes

YANG Jing1*， LIU Fen1， LI Yi1， WU Dongbo1， DENG Mandan1， YANG Chengying1， YIN Chen2， HU Xiang2

（1. Department of Obstetrics and Gynecology， the First Hospital of Changsha， Changsha 410005， China; 2. College of Life Sciences， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

Abstracts： This study aimed to investigate the the effectiveness and mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUCMSCs） in mice with gestational diabetes mellitus （GDM） model， and to study a new method for the treatment of GDM. hUCMSCs were obtained by tissue block culture. Female mice were raised with intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ） solution to induce type 2 diabetes after being fed with D12451 high-fat. Then， mice with type 2 diabetes mellitus were kept in cages overnight， both male and female. Sperm were examined the next morning using pubic plugs and microscopic sperm， which was recorded as the first day of gestation， and fasting blood glucose was measured on the fourth day of gestation. The animals with fasting blood glucose higher than of 11.2 mmol/L and polydipsia， polyphagia， and polyuria were designated as GDM model mice. After injecting 5×105 hUCMSCs into the tail vein to treat GDM model mice， the effects of hUCMSCs on GDM mice were analyzed by detecting changes in blood glucose levels，serum inflammatory factors， macrophages， pathological sections of islet cells， and other indicators. Blood glucose levels of GDM mice treated with hUCMSCs were significantly reduced （0.001lt;Plt;0.01）. Immunohistochemical results showed that the ratio of islet-β-cells to α-cells increased significantly in the mice after treatment with hUCMSCs （0.001lt;Plt;0.01）. The results of inflammatory factor detection showed that the expression of pro-inflammatory factor IL-1β was reduced in the treatment group compared with the control group（Plt;0.05）. In vitro cell experiments showed an increase in the expression of M1 macrophages co-cultured with hUCMSCs. It indicated that hUCMSCs can reduce the blood glucose level of GDM mice to a certain extent and effectively affect their immunomodulatory effect，which is beneficial to the treatment of GDM in mice.

Key words： human umbilical cord mesenchymal stem cells; gestational diabetes mellitus; inflammatory factors; sugar metabolism; model mice

（Acta Laser Biology Sinica， 2024， 33（3）： 236-242）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）指妊娠期發生的糖代謝異常，是妊娠期最常見的一種并發癥［1］。近年來，隨著生活水平的不斷提高，GDM的發病率也不斷上升。但由于缺乏公認的診斷標準和篩查程序的不同，不同國家的GDM患病率難以估計。目前，關于GDM的發病機制尚無統一定論，多數認為和不良的飲食習慣、環境、遺傳有關，妊娠期激素水平導致血糖代謝異常和機體的胰島素抵抗也是其發病的重要原因。同時有研究表明，GDM與2型糖尿病在危險因素、易感基因以及病理生理機制方面有很多相似之處［2］。

根據國際糖尿病聯合會糖尿病圖譜第10版報告，GDM影響著全球約17%的妊娠，相當于每年受妊娠期高血糖影響的活產兒總數高達2 100萬［3］。GDM孕婦血糖通常在分娩后恢復至正常水平，但是GDM對孕婦及胎兒會造成一定的不良后果。具體風險包括自然流產、胎兒異常、先兆子癇、胎兒死亡、巨大兒、新生兒低血糖、高膽紅素血癥和新生兒呼吸窘迫綜合征等［4］。此外，在妊娠終止后，GDM婦女未來發生2型糖尿病和心血管疾病的風險顯著增加［5］，其后代出現兒童期糖耐受損傷、肥胖和2型糖尿病的風險同樣顯著增加［6］。這導致了肥胖和糖尿病的惡性代際循環，影響了整個人口的健康。在過去的幾十年中，我國GDM的患病率持續增加。據Meta分析，我國GDM總患病率約為13%［7-9］。GDM對我國公共衛生的影響越來越明顯，給人口和個人層面造成了巨大的社會、經濟和健康負擔。

目前針對GDM的治療或預防策略，主要是基于生活方式的干預（飲食和運動），包括患者自我監測血糖水平、飲食調整和營養監測、生活方式改變和孕期體重增加管理。高達70%～85%的GDM患者可通過適當的體力活動以及飲食和生活方式調整來控制，但15%～30%的GDM患者盡管調整了飲食和生活方式，血糖控制仍不足，需要藥物治療［10-11］。胰島素是治療GDM的首選藥物，二甲雙胍和格列本脲已被證明可以穿過胎盤進入胎兒，導致新生兒低血糖，不應用作一線藥物［4］。現行方法雖然可以恢復母體的血糖，但其有益作用并未反映在胎兒和新生兒的代謝上，沒有明顯的改善妊娠結局［12］。因此，我們仍需積極尋求安全、有效且易于管理的新療法。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有多向分化潛能和自我復制生物學特性的多能成體干細胞，可從成體和新生兒圍產組織中提取。因其不表達MHC-Ⅱ分子和B7等共刺激分子［13］，不易引起同種異體免疫反應，是一種理想的外源性修復種子細胞，被廣泛應用于各種組織損傷領域；又因其強大的免疫調節作用被廣泛應用于代謝性疾病研究。截至2024年1月，在美國臨床試驗數據庫（https：//clinicaltrials.gov）上可檢索到“mesenchymal stem cells”相關的臨床研究項目為1 235項，MSCs治療2型糖尿病相關的臨床研究項目有17項，治療1型糖尿病相關的項目有23項（其中2項與2型糖尿病重復），其MSCs來源主要為臍帶和骨髓。這些試驗項目試圖評估其功效并了解MSCs的作用機制，尤其是在調節免疫反應方面［14］。早期，研究者們假設了MSCs在1型糖尿病治療中發揮作用的3種可能機制：1）利用MSCs衍生的胰腺祖細胞發育成能夠恢復正常血糖的功能性β細胞；2）利用未分化的MSCs在體內移植后通過直接轉分化產生β細胞；3）利用未分化的MSCs維護患者自身胰島的健康，而非分化為胰腺祖細胞。目前，在體外和體內都缺乏強有力的證據來支持MSCs可以體內分化為功能成熟的β細胞或胰島樣器官的假設。更有可能的是，這些移植的MSCs對內源性胰島具有免疫調節和/或保護作用。

諸多研究都證實了MSCs對治療1型、2型糖尿病有效，但關于MSCs與GDM的研究較少。基于GDM患者為2型糖尿病的高危人群，GDM與2型糖尿病在危險因素、易感基因以及病理生理機制方面有很多相似之處［2， 15］，我們推測，MSCs或許對GDM同樣有效。因此，本研究選用人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs），研究其對GDM的療效及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑耗材

DMEM/F-12培養基（Gibco），細胞培養皿（Gibco），100×青霉素-鏈霉素溶液（Pricella），CD73、CD90、CD34、CD45流式細胞術抗體（Biolegend）， CD206鼠抗、iNOS鼠抗（Biolegend），成骨成脂誘導試劑盒（ThermoFisher），明膠（Sigma），多聚甲醛固定液（Servicebio），RIPA裂解液（Beyotime），鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma），蛋白Marker（Thermo），化學發光底物（Thermo），反轉錄試劑盒（Thermo），qPCR試劑盒（TaKaRa），白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β） 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司），小鼠胰島素免疫組化試劑盒（YLKbio），小鼠胰高血糖素免疫組化試劑盒（YLKbio）。

1.1.2 試驗動物

本研究所使用的C57/6J小鼠（Mus musculus）購買于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證編號為SCXK（湘）2019-0014。本研究動物試驗方案通過了湖南師范大學倫理委員會審核，倫理審核編號為（2021）倫審【臨研】第（50）號。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離及鑒定hUCMSCs

無菌條件下取出健康足月生產的臍帶組織10 cm（采集前臍帶捐獻者已簽署《臍帶樣本采集及捐獻知情同意書》和《臍帶組織捐獻者健康調查表》），用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗血液后，清除臍帶動靜脈、剝離外膜，得到華通氏膠組織。將組織剪成0.5～1.0 mm3的組織塊，并種植在培養皿中，用含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12培養基培養，應用組織塊貼壁法進行培養。約一周可見細胞爬出，正常傳代培養。取第3代（passage 3，P3）細胞，通過流式細胞術進行細胞表型鑒定。

1.2.2 檢測hUCMSCs誘導成骨成脂能力

于24孔板中均勻鋪上500 μL 1%明膠，待明膠表面干燥后接種P3代hUCMSCs，待細胞融合至60%～70%后換成相應的成骨或成脂誘導液，成骨或成脂誘導液每2 d更換1次。持續觀察約3周后分別使用茜素紅和油紅O檢測細胞成骨或成脂分化情況。

1.2.3 建立GDM小鼠模型

C57/6J小鼠20只，雌性，4周齡，體重20～30 g，隨機分為4組，分別為對照（NC）組、干細胞注射（NC-hUCMSCs）組、糖尿病（GDM）組、糖尿病干細胞治療（GDM-hUCMSCs）組。NC組、NC-hUCMSCs組飼喂D12450B低脂飼料（10%脂肪），GDM組及GDM-hUCMSCs組飼喂D12451高脂飼料（60%脂肪）。小鼠于前夜禁食，但不禁水，次日早上GDM組及GDM-hUCMSCs組腹腔注射30 mg/kg STZ溶液；NC組、NC-hUCMSCs組腹腔注射等量PBS。注射4 h后可進食，間隔24 h注射3次。高脂飼養8周后剪尾釆血，血糖儀檢測其空腹血糖值，連續測3 d以上，連續空腹血糖濃度gt;11.2 mmol/L且有多尿等癥狀的小鼠為2型糖尿病模型小鼠。

確定2型糖尿病模型小鼠后，將所有小鼠以雄雌1：2的比例合籠過夜，次日早上以陰栓及鏡檢精子記為妊娠第1天，妊娠第4天測空腹血糖，空腹血糖濃度gt;11.2 mmol/L并出現多飲、多食、多尿者定為GDM模型小鼠，并用于后續試驗。

1.2.4 hUCMSCs治療GDM模型小鼠

小鼠妊娠第7天，NC-hUCMSCs組及GDM-hUCMSCs組小鼠每只經尾靜脈注射5×105個hUCMSCs（注射體積100 μL），1周后檢測血糖變化。

1.2.5 免疫功能檢測

注射hUCMSCs 1周后，所有小鼠眼眶取血500 μL，室溫靜置20 min后離心取上清液，上清液分裝后-20℃保存。利用ELISA檢測小鼠血清中的IL-1β。

1.2.6 胰島病理分析

注射hUCMSCs 1周后，將所有小鼠處死，取胰腺于4%多聚甲醛中固定，將胰腺制作成石蠟切片，室溫下用胰島素、胰高血糖素進行組織免疫染色，光學顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細胞的提取與檢測

脊椎脫臼法處死5周大的C57/6J小鼠，于75%酒精中浸泡10 min后移入超凈工作臺；將小鼠腹部朝上，撕開皮膚露出整個腹部，用10 mL注射器抽取5 mL含5%" FBS的DMEM/F12培養基，將針頭插入腹膜注入，使用止血鉗封閉注射創口，小心按摩小鼠腹腔30 min使腹腔巨噬細胞充分游離出來，使用移液器小心抽取腹腔液體，細胞計數后將細胞鋪板。待巨噬細胞貼壁后，收集hUCMSCs匯合度為80%時的培養液，用hUCMSCs培養液培養小鼠腹腔巨噬細胞，培養24 h后，對巨噬細胞進行熒光染色。檢測M1/M2型巨噬細胞表面標志物iNOS（M1型）、CD206（M2型）的表達情況。

2 結果與分析

2.1 分離和鑒定hUCMSCs

組織塊貼壁法培養原代hUCMSCs，約1周可見細胞爬出，繼續培養至細胞融合度達50%左右開始傳代培養。取P3代細胞進行流式細胞術分析細胞表面標志物（所使用流式細胞儀為BD Accuri C6），結果如圖1顯示，CD90、CD73高表達，CD45、CD34低表達，符合hUCMSCs表面標志物的特征。對P3代細胞進行成骨或成脂誘導試驗，顯微鏡下可見，茜素紅染色可見細胞質紅色的礦化結節（圖2a），油紅O染色可見紅色的脂滴（圖2b），表明獲得的細胞具備hUCMSCs的成骨成脂分化能力。

2.2 hUCMSCs對GDM小鼠糖代謝的影響

與NC組比較，未經hUCMSCs治療的GDM組小鼠血糖顯著升高（Plt;0.000 1）；與GDM組比較，經hUCMSCs治療的GDM-hUCMSCs組小鼠在輸注后第2天血糖明顯下降（Plt;0.05），且呈逐漸下降的趨勢，輸注后第7天小鼠的血糖顯著下降（0.001lt;Plt;0.01），更接近于對照組，提示小鼠胰島素抵抗得到明顯減輕（圖3a）。

GDM-hUCMSCs組小鼠體重較GDM組有上升，但無統計學差異（圖3b）。對小鼠的脾臟、胰腺、心臟、肺、腎臟、肝臟的重量進行分析發現，除GDM組較NC組胰臟重量明顯升高（Plt;0.05）之外，其余各組各臟器的重量均無顯著性差異，提示干細胞注射對于小鼠臟器無毒害作用（圖3b、3c）。

2.3 hUCMSCs對GDM小鼠胰島功能的影響

對各組小鼠的胰腺進行免疫組化檢查，結果顯示：GDM組小鼠胰腺內胰島素表達明顯下降，且胰高血糖素的表達明顯上升，β細胞與α細胞比率（beta-to-alpha cell ratio，RBA）降低；輸注hUCMSCs后，GDM-hUCMSCs組較GDM組胰島素的表達有一定的升高，RBA顯著上升（0.001lt;Plt;0.01）。這說明，GDM-hUCMSCs組小鼠在胰島素抵抗明顯改善之后，胰島內β細胞數量增長，α細胞增生受到抑制，同時細胞內胰島素儲備量也增加（圖4）。

2.4 hUCMSCs對GDM小鼠免疫的影響

用ELISA檢測各組小鼠血清中促炎因子IL-1β。結果顯示，GDM組小鼠促炎因子IL-1β的表達明顯升高，經hUCMSCs治療后GDM-hUCMSCs組小鼠表達降低并接近于對照組，提示其炎癥反應得到了緩解與恢復。體外細胞試驗顯示，正常C57/6J小鼠的腹腔巨噬細胞和hUCMSCs共培養后，抑炎型M2型巨噬細胞表面標志物CD206表達相對穩定，而促炎型M1型巨噬細胞表面標志物iNOS的表達明顯降低，提示hUCMSCs可抑制小鼠腹腔巨噬細胞向促炎型M1型極化（圖5）。

3 討論

近年來，研究者們對臍帶間充質干細胞臨床治療的安全性、臍帶間充質干細胞的免疫調節特性、臍帶間充質干細胞對2型糖尿病的有效性進行了廣泛的研究［16-18］。基于以上基礎，本研究將來源于圍產期組織的hUCMSCs注射至GDM模型小鼠體內，觀察其對GDM的治療效果，并進一步分析其發揮作用的可能機制及其對各臟器的影響。試驗結果初步證實了hUCMSCs對GDM小鼠的安全性和有效性，可改善胰島素抵抗、有效促進血糖水平穩定。雖然本研究尚處于動物試驗階段，但積極的結果給我們帶來了新的方向和思路。此外，我們想要尋求GDM治療新方法的原因之一是現有治療手段無法預防或解決GDM造成的肥胖和糖尿病的惡性代際循環，而本研究結果顯示了hUCMSCs對胰島素抵抗、胰島功能修復的積極作用，這提示我們未來或可在hUCMSCs預防相關疾病的發生發展及治療上進一步開展研究。與此同時，我們不得不考慮臍帶間充質干細胞的活細胞屬性可能限制了其在GDM中的應用研究與發展。一方面，由于妊娠期的特殊性，妊娠期疾病的治療藥物和方法使用都較其他時期和人群更為嚴苛，盡管在其他疾病的臨床研究中已經多次證實其安全性，但是人們依然會擔心活細胞在體內不可控增殖造成母嬰不良影響。另一方面，因為活細胞的儲存與運輸條件嚴苛，一般需在MSCs收獲后8 h內使用，否則細胞存活率和表型會發生變化，這大大限制了MSCs的應用范圍。

本研究結果初步提示，hUCMSCs具有通過免疫調節作用發揮治療小鼠GDM的積極作用，但hUCMSCs發揮作用的具體關鍵物質與詳細機制還有待進一步闡明。為此，我們也查閱和關注了hUCMSCs的衍生物，尤其是外泌體，在疾病治療中的研究進展。外泌體是由細胞質膜內陷形成的，包含有母細胞釋放的顆粒物質的多泡內體或多泡小體，攜帶了母細胞的生物活性物質并具有與母細胞相似的歸巢能力，被認為在MSCs和靶細胞之間充當著旁分泌介質的作用［19-20］。且外泌體不是活體細胞，不存在移植細胞在體內存留的問題，無致瘤促瘤作用［21-23］。未來我們將提取hUCMSCs來源的外泌體代替hUCMSCs進行深入研究，以尋找治療GDM的更優策略。

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