Periostin表達在乳恒牙替換中的臨床意義

張勇 張洪蘭 秦晗

[摘要]?目的?探討Periostin在替牙期對骨改建和自噬的影響，研究Periostin在乳恒牙替換過程中調節骨代謝平衡的作用機制。方法?收集筆者所在醫院因乳牙根尖周病及多生牙拔除的牙根周圍粘連牙槽骨，體外培養成骨細胞，分為實驗組和對照組各15例，實驗組培養基中加Periostin，原位雜交法檢測標本中Periostin、骨代謝基因、自噬基因的mRNA水平。蛋白質印記法檢測成骨細胞中骨代謝蛋白，自噬蛋白表達。結果?原位雜交結果顯示，實驗組Periostin表達低于對照組（P<0.05），核因子κB受體活化因子配體（receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand，RANKL）、LC3、BECN1表達及RANKL/骨保護素（osteoprotegerin，OPG）值高于對照組（均P<0.05），OPG表達差異無統計學意義（P>0.05）；蛋白質印跡法顯示實驗組RANKL、RANKL/OPG、LC3Ⅱ、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與對照組比較水平低（均P<0.05），OPG、LC3Ⅰ較對照組差異無統計學意義（均P>0.05）。結論?Periostin通過降低RANKL表達及改善過強自噬狀態，從而減少炎癥所致的骨吸收。

[關鍵詞]?骨膜蛋白；骨改建；乳恒牙替換；自噬

[中圖分類號]?R788????[文獻標識碼]?A ????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.02.001

Clinical?significance?of?Periostin?expression?in?the?replacement?of?primary?permanent?teeth

ZHANG?Yong1，?ZHANG?Honglan2，?QIN?Han1

1.Department?of?Stomatology，?Lianyungang?Clinical?Medical?College?Nanjing?Medical?University，?Lianyungang?222000，?Jiangsu，?China;?2.Department?of?Pathology，?Lianyungang?Clinical?Medical?College?Nanjing?Medical?University，?Lianyungang?222000，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?periostin?on?bone?remodeling?and?autophagy?during?the?period?of?tooth?replacement?and?to?investigate?the?mechanism?of?action?of?periostin?in?regulating?the?balance?of?bone?metabolism?during?the?replacement?of?primary?and?permanent?teeth.?Methods?Fifteen?cases?each?of?experimental?and?control?groups?were?collected?from?the?periapical?periodontal?disease?and?multiple?teeth?extracted?for?periapical?adhesions?in?the?author’s?hospital，?the?mRNA?levels?of?periostin，?bone?metabolism?genes，?and?autophagy?genes?were?detected?in?the?specimens?by?in?situ?hybridization.?Osteoblasts?were?cultured?in?vitro，?periostin?was?added?to?the?culture?medium?of?the?experimental?group，?and?the?expression?of?bone?metabolism?proteins?[receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand?（RANKL），?osteoprotegerin?（OPG）]?and?autophagy?proteins?（LC3，?Beclin-1）?in?osteoblasts?was?detected?by?Western?blot.?Results?In?situ?hybridization?results?showed?that?periostin?expression?in?the?experimental?group?was?lower?than?that?in?the?control?group?（P<0.05），?RANKL，?LC3，?BECN1?expression?and?RANKL/OPG?values?were?higher?than?those?in?the?control?group?（all?P<0.05），?and?no?significant?differences?were?seen?in?OPG?expression?（P>0.05）;?protein?blotting?showed?that?RANKL，?RANKL/OPG，?LC3Ⅱ，?Beclin-1，?LC3Ⅱ/LC3Ⅰ?were?lower?in?the?experimental?group?than?in?the?control?group?（all?P<0.05），?and?no?significant?differences?were?seen?in?OPG?and?LC3Ⅰ?than?in?the?control?group?（P>0.05）.?Conclusion?Periostin?reduces?inflammation-induced?bone?resorption?by?reducing?RANKL?expression?and?improving?hyperautophagic?state.

[Key?words]?Periostin;?Bone?remodeling;?Tooth?replacement;?Autophagy

骨膜蛋白（Periostin）是一種細胞外基質（extracellular?matrix，ECM）蛋白，最初即是發現于成骨細胞當中，在骨重塑的過程中，Periostin表達水平升高并具有維持正常骨改建的作用[1-2]。乳恒牙替換是骨改建十分活躍的生理活動，乳牙根尖周炎會導致骨吸收增強，骨形成減弱[3]。由成骨細胞等細胞分泌產生的核因子κB受體活化因子配體（receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand，RANKL）能夠與核因子κB受體活化因子（receptor?activator?of?nuclear?factor-κB?ligand，RANK）結合激活破骨細胞，骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和RANK競爭與RANKL結合減弱破骨細胞活性，因此RANKL、OPG的相對水平可以反應骨吸收的活躍程度，即RANKL/OPG比值高時，骨吸收活躍，反之，則骨吸收受抑制[4-7]。乳恒牙替換異常的一項重要原因是根尖周炎癥導致的過強骨吸收[8]。

炎癥與自噬之間關系密切，自噬被視為機體的一種防御功能，它具有清除受損細胞器和感染病原體的能力，同時自噬能夠修飾病原體，使其病原體能夠穩定的存在于宿主體內，這表明自噬與炎癥之間存在雙向調節作用，維持組織平衡[9-12]。Izuhara等[13]研究結果表明，感染性炎癥加重時，Periostin表達水平降低。微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule?associated?protein?1?light?chain，LC3）和Beclin-1是被廣為認可的自噬標志物，其中LC3基因編碼的蛋白隨自噬活動變化分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，其中LC3Ⅱ/LCI的比值反映了自噬強度，該值越高，自噬越強，反之，自噬越弱，Beclin-1是由BECN1基因編碼的蛋白質，上調Beclin-1會增強自噬水平[14-18]。本研究通過檢測臨床標本和細胞中不同Periostin水平下骨代謝和自噬強度的影響，初步探討Periostin在乳恒牙替換過程中調節骨代謝平衡的機制。

1??材料與方法

1.1??主要材料

牙槽骨標本（南京醫科大學連云港臨床醫學院）、原位雜交試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）、DAB染色劑（北京中杉金橋生物科技有限公司）、小鼠成骨細胞系（中國科學院上海細胞庫）、胎牛血清（上海威正翔生物科技有限公司）、BCA蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）、蛋白質預染標志物（上海賽默飛世爾有限公司）、ECL-PLUS試劑盒（上海賽默飛世爾有限公司）、SDS-PAGE蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司）、蛋白轉能儀（上海天能科技有限公司）、離心機（上海賽默飛世爾有限公司）、倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）、生物安全柜（上海振祥創科技有限公司）、CO2培養箱（日本三洋貿易株式會社）。本研究經過連云港市第一人民醫院醫學倫理委員會審查（倫理審批號KY-20220224003）。

1.2??原位雜交臨床標本

收集所在醫院2021年9月至2022年6月重度乳牙根尖周病拔除的滯留乳牙為標本，甲酸脫鈣4周，制備成組織切片，使用多聚賴氨酸處理過的載玻片，脫蠟至水，30%過氧化氫滅活內源性酶，胃蛋白酶暴露核酸片段，4%多聚甲醛后固定標本，按原位雜交試劑盒進行組織化學染色，依次進行與預雜交、雜交，分別加入封閉液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶，DAB鏡下控制染色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察Periostin、核因子κB受體活化因子配體（receptor?activator?of?nuclear?factor-κb?ligand，RANKL）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、BECN1、LC3的mRNA表達，使用Image?J量化分析表達。

1.3??成骨細胞培養與分組

取出購置的成骨細胞系，在37℃?5%CO2的培養箱中分實驗組（n=15，a-MEM培養基）和對照組（n=15，a-MEM培養基）進行，每3d傳代1次，取處于對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化成細胞懸液，接種至培養板上，觀察細胞生長情況，體外培養的成骨細胞貼壁生長，分布均勻，形態多樣，豐富的胞質向外生長出生長突，細胞核清晰，呈圓形或卵圓形。

1.4??Western?blot法檢測成骨細胞中的RANKL、OPG、Beclin-1、LC3蛋白表達

在進行WB實驗取樣前3d換液，并在實驗組培養基中加入濃度為75ng/μl的Periostin。收集成骨細胞，預冷PBS洗滌培養細胞，細胞裂解液充分裂解細胞，4℃?12?000r/min?15min離心，取上清于新離心管中，蛋白定量，根據RANKL、OPG、Beclin-1、LC3蛋白大小配置不同的濃度的SDS-PAGE膠，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺凝膠法電泳，電泳完成后在4℃?100V的條件下2h，將蛋白轉移至PVDF膜上。取出PVDF膜，4℃過夜。加入第一抗體Beclin-1（1∶300）、LC3（1∶300）、OPG（1∶100）、RANKL（1∶85），4℃過夜。孵育完成后，PBS洗滌PVDF膜3次，分別加入第二抗體兔抗，其中RANKL為鼠抗IgG（1∶2000），室溫孵育1h，PBS洗滌3次，X線曝光、顯影、定影，結果分析。內參選用GAPDH（小鼠，上海Santa?Cruz生物技術有限公司，1∶2000，36kDa）。

1.5??統計學方法

采用SPSS22.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量數據均數±標準差（）表示，實驗組和對照組進行t檢驗，以P<0.05差異有統計學意義。

2??結果

2.1??臨床標本原位雜交結果分析

滯留乳牙根尖周炎組織中Periostin的表達水平明顯低于正常牙槽骨組織（0.18±0.01?vs.?0.26±0.04，P<0.05）；正常牙槽骨組織中RANKL、RANKL/OPG、LC3、BECN1均顯著低于滯留乳牙根尖周炎組織（0.16±0.01?vs.?0.23±0.02，P<0.05；0.84±0.16?vs.?1.35±0.07，P<0.05；0.21±0.02?vs.?0.30±0.03，P<0.05；0.16±0.03?vs.?0.31±0.04，P<0.05）；滯留乳牙根尖周病組織和正常牙槽骨組織中OPG的表達水平差異無統計學意義（0.17±0.03?vs.?0.19±0.01，P>0.05）。見表1，圖1。

2.2??Western?blot法檢測體外培養的成骨細胞結果分析

體外培養的成骨細胞貼壁生長，分布均勻，形態多樣，豐富的胞質向外生長出生長突，細胞核清晰，呈圓形或卵圓形。見圖2。

培養基中含Periostin的實驗組RANKL、RANKL/OPG、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均較對照組表達水平低（0.57±0.03?vs.?0.72±0.05，P<0.05；0.56±0.01?vs.?0.64±0.04，P<0.05；0.89±0.11?vs.?1.28±0.20，P<0.05；0.96±0.04?vs.?1.26±0.05，P<0.05，0.86±0.06?vs.?1.19±0.09，P<0.05）。兩組OPG、LC3Ⅰ比較差異無統計學意義（1.02±0.12?vs.?1.12±0.10，P>0.05；1.20±0.10?vs.?1.06±0.09，P>0.05），Periostin

能夠降低RANKL、RANKL/OPG和自噬水平，見表2，圖3。

3??討論

乳恒牙替換過程需要骨吸收與骨形成的相互作用，部分乳牙根尖周炎會引起牙根根尖及周圍牙槽骨病變吸收，而由于炎癥的作用，骨形成未能正常進行，部分患者就會出現牙齒替換異常，嚴重影響了牙列完整和健康，同時研究發現牙齒萌出和成骨細胞分化的過程中，Periostin表達是明顯增加的[19-21]。但Periostin如何調節乳恒牙替換的具體機制仍不明確。

在乳恒牙替換時，乳牙根及其與恒牙胚之間的牙槽骨吸收形成萌出通道，同時，隨著恒牙胚的生長發育，恒牙牙根逐漸形成，并在牙胚周圍及根方形成新的牙槽骨[22-23]。RANKL/OPG的比值反映了骨吸收的活躍程度，因此在乳恒牙替換過程中，RANKL/OPG的比值維持在一個合理的區間，才能使替牙期間骨改建的正常進行。在本研究顯示，根尖周炎標本中的RANKL/OPG的比值明顯高于對照組，而Periostin表達卻低于對照組，另一部分細胞實驗顯示，含Periostin培養基培養的成骨細胞中，RANKL/OPG的比值明顯低于對照組，二者均表明Periostin的表達水平與RANKL/OPG時負相關的。由此推測，Periostin對根尖周炎所致的骨吸收可能有一定的抑制作用。

自噬與炎癥之間存在密切聯系，細胞自噬既能夠通過自身生理活動清除入侵的病原體，也會因為過強的細胞自噬消耗過多的自噬轉運蛋白而減弱線粒體自噬，從而引起活性氧（reactive?oxygen?species，ROS）積累，激活炎癥小體[24-25]。在本研究中，病原體入侵引起根尖周組織的炎癥，LC3和BECN1的mRNA表達水平證實了炎癥標本中較強的細胞自噬，對照組中Periostin表達高于實驗組，另一部分細胞實驗顯示，培養基中含Periostin的成骨細胞中的Beclin-1水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，表明Periostin表達水平與自噬是負相關的，提示Periostin可能可以通過調節細胞自噬，主要是以降低過強自噬使其達到一個相對正常的水平來降低炎癥對于骨吸收的損害狀況，從而保障成骨細胞的正常功能，達到乳恒牙正常替換的目的。

Periostin如今已經被廣泛用于骨組織損傷的治療中，它能夠加速損傷愈合，加快骨代謝的速度，Periostin對于組織損傷修復的作用有一部分是通過降低或者抑制損傷區域的炎癥反應實現的[26-27]。此外，研究表明Periostin的過表達能夠上調骨形成速率和骨量，提示Periostin既能夠抑制骨吸收，也能促進骨形成[28]。

綜上，Periostin一方面可能通過抑制由于炎癥導致的過多RANKL的產生，使RANKL/OPG比值減小，使骨吸收活動減弱；另一方面，Periostin可以調低過強的細胞自噬活動來改善嚴重的乳牙根尖周炎環境，從而減少因炎癥導致的骨吸收過多。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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