豬傳染性胸膜肺炎疫苗抗原ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：" 豬胸膜肺炎放線桿菌是一種高度傳染性、致死性呼吸道疾病，已造成養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重?fù)p失。細(xì)胞毒素Apx Ⅱ是豬胸膜肺炎PCP（Porcine contagious pleuropneumonia）的主要抗原之一，可以作為豬胸膜肺炎疫苗的有效成分。谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）具有無內(nèi)毒素和較發(fā)達(dá)分泌系統(tǒng)的優(yōu)點，是非常有潛力的重組細(xì)菌疫苗蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。利用C.glutamicum表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)Apx Ⅱ，實現(xiàn)其高效穩(wěn)定表達(dá)，可為疫苗生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。前期研究已構(gòu)建Apx Ⅱ分泌表達(dá)菌株，為進(jìn)一步提高Apx Ⅱ的表達(dá)產(chǎn)量，通過在24孔板發(fā)酵優(yōu)化，得到最優(yōu)的培養(yǎng)基為CGXⅡ-YT，最優(yōu)的表達(dá)溫度為30 ℃，IPTG濃度為1.0 mmol/L，加入IPTG前培養(yǎng)6 h，發(fā)酵培養(yǎng)時間為24 h。進(jìn)一步在搖瓶中放大發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果與24孔板發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果相同。最后在容積為5 L發(fā)酵罐中對Apx Ⅱ進(jìn)行表達(dá)，與使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵相比，使用CGXⅡ-YT發(fā)酵培養(yǎng)基，且在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下Apx Ⅱ表達(dá)量明顯提高，達(dá)到了114.60 mg/L。本研究實現(xiàn)了Apx Ⅱ在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達(dá)，為其進(jìn)一步擴(kuò)大化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：" 細(xì)胞毒素ApxⅡ；谷氨酸棒桿菌；表達(dá)

中圖分類號：" S858.28""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2310-07

收稿日期：2024-02-08

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（22078128）

作者簡介：程世前（1996-），男，河南義馬人，碩士，主要從事發(fā)酵工程、醫(yī)藥蛋白表達(dá)等方面的研究。（E-mail）c5886602123@163.com

通訊作者：白仲虎，（E-mail）baizhonghu@jiangnan.edu.cn

程世前，康競藝，陳萌軒，等. 豬傳染性胸膜肺炎疫苗抗原ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2024，40（12）：2310-2316.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.014

Expression of porcine contagious pleuropneumonia vaccine antigen ApxⅡ in Corynebacterium glutamicum and optimization of fermentation conditions

CHENG Shiqian1，" KANG Jingyi1，" CHEN Mengxuan1，" LIU Xiuxia1，2，3，" YANG Yankun1，2，3，" BAI Zhonghu1，2，3

（1.National Engineering Research Center of Cereal Fermentation and Food Biomanufacturing， Jiangnan University， Wuxi 214122， China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnongy， Ministry of Education， Jiangnan University， Wuxi 214122， China;3.Jiangsu Engineering and Technology Research Centre for Bioactive Product Processing， Wuxi 214122， China）

Abstract：" Actinobacillus pleuropneumoniae is a highly infectious and fatal respiratory disease， which has caused serious losses in the pig industry. Apx Ⅱ is one of the main antigens of porcine contagious pleuropneumonia （PCP）， which can be used as an effective component of porcine pleuropneumonia vaccine. Corynebacterium glutamicum has the advantages of endotoxin-free and more developed secretion system， and is a very promising recombinant bacterial vaccine protein expression system. The expression system of C. glutamicum was used to produce Apx Ⅱ and achieve its efficient and stable expression， which could provide a research basis for vaccine production. Apx Ⅱ secretory expression strains were constructed in previous studies. In order to further improve the expression yield of Apx Ⅱ， the fermentation in 24-well plates was optimized. The optimal medium was CGXII-YT， and the optimal expression temperature was 30 ℃. The concentration of IPTG was 1.0 mmol/L， the culture time was 6 h before adding IPTG， and the fermentation culture time was 24 h. The results were the same as those of 24-well plate fermentation. Finally， Apx Ⅱ was expressed in a 5 L fermentor. Compared with the basic fermentation medium， the Apx Ⅱ expression yield was significantly increased by using CGXⅡ-YT fermentation medium， and the Apx Ⅱ expression yield reached 114.60 mg/L under the optimized fermentation conditions. In this study， the secretory expression of Apx Ⅱ in Corynebacterium glutamicum was realized， which provided a basis for its further expansion of production.

Key words： "cytotoxin ApxⅡ;Corynebacterium glutamicum;expression

豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumonia， APP）是豬傳染性胸膜肺炎的病原體，具有高度傳染性，通常是致命的，已成為豬的主要傳染病原菌之一，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大影響。典型的亞單位疫苗有轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白質(zhì)（Tbp）、蛋白酶、滲透因子和菌毛等。其中，細(xì)胞毒素Apx、Tbp具有免疫原性，是APP的抗原，可以作為疫苗的有效成分。細(xì)胞毒素Apx會破壞菌體自身形態(tài)造成發(fā)病。ApxⅡ是除了血清型10外，都能體現(xiàn)Apx的一類毒素，所以ApxⅡ是Apx毒素中最有前途的候選疫苗。Wang等通過給豬單獨注射或添加到由重組ApxI、ApxII、ApxIII毒素和外膜蛋白質(zhì)組成的多組分重組亞單位疫苗中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對各種豬傳染性胸膜肺炎（PCP）免疫反應(yīng)都有一定的防護(hù)性。然而中國新型疫苗研究起步較晚，研究主體有高校和科研院所，如何實現(xiàn)獸用疫苗高質(zhì)量、低成本生產(chǎn)仍然是各大疫苗企業(yè)關(guān)注的重點。

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）于1950年首次被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，因其具備高產(chǎn)L-谷氨酸的特點，故命名為谷氨酸棒桿菌。C.glutamicum屬于放線綱放線菌目棒狀桿菌屬，特點是嚴(yán)格好氧，不產(chǎn)生孢子且血清甘膽酸（CG）含量高，被認(rèn)作是食品級安全型微生物。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒桿菌在重組蛋白質(zhì)分泌途徑上同樣具備此類特性，首先它具有非常優(yōu)良的無內(nèi)毒素特征，不會影響疫苗質(zhì)量；其次是它的分泌表達(dá)體系完善，包含兩個完善的分泌途徑（Sec途徑和Tat途徑），具有很好的表達(dá)蛋白體系；最后是其在胞外具有很少的蛋白酶。

本研究首先利用多孔板將ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，然后將其發(fā)酵工藝放大至搖瓶水平以及容積為5 L發(fā)酵罐水平，驗證此發(fā)酵工藝的有效性，并首次在容積為5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647分泌表達(dá)ApxⅡ，探究谷氨酸棒桿菌對ApxⅡ表達(dá)的可行性，對其作為宿主菌株表達(dá)外源蛋白生產(chǎn)疫苗提供可行性方案。

1" 材料與方法

1.1" 菌株和質(zhì)粒

Apx Ⅱ表達(dá)載體pXMJ19-tac-CspB-ApxⅡ#5和谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647均由江南大學(xué)實驗室保存。

1.2" 培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基（LBB）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，BHI 10 g/L。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO4 1 g/L，（NH4）2SO4 20 g/L，KH2PO4 1 g/L，BHI 30 g/L，葡萄糖 30 g/L。補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖300 g/L。 供試發(fā)酵培養(yǎng)基有LB、LBB、BHI、CGXⅡ、CGXⅡ-YT。

1.3" 主要儀器和試劑

質(zhì)粒提取使用CWBIO試劑盒（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司產(chǎn)品）。序列插入使用DNA連接酶，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）使用Es Taq聚合酶（江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司產(chǎn)品）或PrimerSTAR進(jìn)行。DNA連接酶購自賽默飛世爾科技公司；氯霉素購于上海麥克林生化科技股份有限公司；其余培養(yǎng)基試劑均從上海國藥集團(tuán)有限公司購置。使用的儀器包括成都英德生物醫(yī)藥設(shè)備有限公司生產(chǎn)的恒溫?fù)u床，賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、超低溫冰箱和凝膠成像儀，瑞士Tecan公司生產(chǎn)的多功能酶標(biāo)儀，天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的恒溫金屬浴，上海天能科技有限公司生產(chǎn)的核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)凝膠電泳系統(tǒng)，上海棱光技術(shù)有限公司生產(chǎn)的紫外分光光度計等。

1.4" 應(yīng)用24孔板與搖瓶培養(yǎng)ApxⅡ

挑取培養(yǎng)皿中單克隆菌株接種到搖瓶中（瓶中含10 mL LBB培養(yǎng)基），并放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min培養(yǎng)12 h，隨后吸取200 μL上述種子液至深孔板中（24孔，每孔含1.8 mL LBB 培養(yǎng)基），再次放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，當(dāng)孔內(nèi)菌體呈生長狀態(tài)后添加適量濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，培養(yǎng)24 h后在600 nm波長下測定吸光度（OD600），繪制生長柱圖。在搖瓶培養(yǎng)中，挑取單克隆菌株進(jìn)行接種（LBB培養(yǎng)基體積占搖瓶容積的1/10），隨后放置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min培養(yǎng)12 h后，吸取1 mL上述種子液至新的搖瓶培養(yǎng)基中，保持30 ℃恒溫，220 r/min培養(yǎng)4～6 h，再向搖瓶中添加適量濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定OD 600，繪制生長柱圖。

1.5" ApxⅡ 5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)

單菌落在LBB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，按10%接種量轉(zhuǎn)接到5 L發(fā)酵罐中（罐內(nèi)含1.8 L發(fā)酵培養(yǎng)基）。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)速設(shè)定與溶解氧含量相偶聯(lián)，其溶解氧設(shè)定為30%，pH設(shè)定為7，用氨水和10%磷酸調(diào)節(jié)pH，罐體溫度設(shè)定為30 ℃。每4 h取1次樣，整個培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)速設(shè)定為450～1 000 r/min。發(fā)酵8 h時后加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并開啟補(bǔ)料循環(huán)泵（補(bǔ)充300 g/L的葡萄糖），流速為4 mL/（h·L）。每隔4 h取樣1次，測定OD600，繪制生長圖。

1.6" ApxⅡ SDS-PAGE分析和BSA蛋白濃度

將蛋白質(zhì)樣品離心后取上清液分別與5×上樣緩沖液混合，制備成SDS-PAGE蛋白凝膠電泳樣品。所有的樣品用質(zhì)量濃度為120 g/L的SDS-PAGE進(jìn)行分析，隨后用考馬斯亮藍(lán)染色10 min并放置于勻速搖板上搖晃，去染色液后加入脫色液過夜，搖晃直至膠體變透亮后進(jìn)行凝膠成像拍攝。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定使用BCA試劑盒，將蛋白質(zhì)標(biāo)品定量分別配制成0.025 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.200 mg/L、0.300 mg/L、0.400 mg/L、0.500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品，利用凝膠成像圖分析蛋白質(zhì)純度，根據(jù)不同質(zhì)量濃度BSA繪制標(biāo)準(zhǔn)柱圖，使用軟件Image J測定數(shù)值隨后代入標(biāo)準(zhǔn)柱圖中定量蛋白質(zhì)ApxⅡ。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 多孔板水平ApxⅡ生產(chǎn)的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1" ApxⅡ培養(yǎng)基的確定" 為確定用于優(yōu)化ApxⅡ生產(chǎn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選用LB、LBB、BHI、CGXⅡ、CGXⅡ-YT 5種培養(yǎng)基，對獲得ApxⅡ最優(yōu)表達(dá)重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基使用LBB，將平板上單菌落菌株接種到搖瓶內(nèi)LBB培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按照2%接種量將其分別轉(zhuǎn)接到BHI、LB、LBB、CGXⅡ及CGXⅡ-YT搖瓶培養(yǎng)基中，經(jīng)24 h搖床發(fā)酵培養(yǎng)后，測定其生物量并進(jìn)行SDS-PAGE分析。選擇表達(dá)量最高的CGXⅡ-YT培養(yǎng)基為ApxⅡ生產(chǎn)培養(yǎng)基（圖1）。

2.1.2" 碳源對ApxⅡ表達(dá)的影響" 在24孔板中分別將果糖、蔗糖、山梨醇、甘油、葡萄糖、木糖、麥芽糖、乙醇添加到不含葡萄糖碳源的CGXⅡ-YT培養(yǎng)基中，使其最終質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L；再分別接入10%等量的ApxⅡ種子培養(yǎng)基，在30 ℃和220 r/min 條件下誘導(dǎo)后培養(yǎng)24 h，收集發(fā)酵液的上清液，測定其生物量并進(jìn)行SDS-PAGE分析。根據(jù)圖2所示，當(dāng)葡萄糖作為碳源時，其細(xì)菌生長情況與ApxⅡ表達(dá)水平均最佳，因此后續(xù)使用葡萄糖作為碳源。

2.1.3" 氮源對 ApxⅡ表達(dá)的影響" 在24孔板中分別將Yeast extract（進(jìn)口）、Tryptone（進(jìn)口）、大豆蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、酪蛋白水解物、尿素、氯化銨添加到不含氮源的CGXⅡ-YT培養(yǎng)基中，使其最終質(zhì)量濃度達(dá)到18 g/L。分別接入10%等量的ApxⅡ種子培養(yǎng)基，在30 ℃和220 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，收集發(fā)酵液的上清液，測定其生物量并進(jìn)行SDS-PAGE分析。根據(jù)圖3所示，大豆蛋白胨作為氮源時，其細(xì)菌生長情況與ApxⅡ表達(dá)水平均為最佳，因此選擇大豆蛋白胨作為氮源。

2.1.4" 誘導(dǎo)溫度對ApxⅡ表達(dá)量的影響" 為探究誘導(dǎo)溫度是否有利于ApxⅡ的可溶表達(dá)。在24孔板中使用不同誘導(dǎo)溫度，觀察其對ApxⅡ表達(dá)量的影響。發(fā)酵前期在30 ℃條件下培養(yǎng)6 h，然后加入誘導(dǎo)劑分別調(diào)節(jié)溫度至20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃。如圖4所示，誘導(dǎo)溫度為30 ℃時ApxⅡ的表達(dá)水平最高，后續(xù)試驗誘導(dǎo)溫度選用30 ℃。

2.2" 搖瓶中ApxⅡ生產(chǎn)的發(fā)酵條件優(yōu)化

將先前探究的24孔板Apx Ⅱ表達(dá)條件放大到搖瓶規(guī)模進(jìn)行Apx Ⅱ表達(dá)，根據(jù)不同誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑添加量，在CGXⅡ-YT培養(yǎng)基中接入10%種子培養(yǎng)基，在30 ℃和220 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，測量表達(dá)菌株生物量并取樣品上清液進(jìn)行分析。如圖5所示，在搖瓶規(guī)模放大試驗中獲得最佳條件為：誘導(dǎo)溫度30 ℃，誘導(dǎo)劑添加濃度為1 mmol/L IPTG。

2.3" ApxⅡ在5 L發(fā)酵罐中的表達(dá)

將ApxⅡ表達(dá)菌株在LBB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接到含有1.8 L發(fā)酵培養(yǎng)基的容積為5 L的發(fā)酵罐中。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵12 h后加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并開啟補(bǔ)料循環(huán)泵，流速為4 mL/（h·L）。每隔4 h取樣1次，

記錄OD600，離心去樣品上清液與5×上樣緩沖液混合后進(jìn)行SDS-PAGE分析，將BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE分析和灰度分析，將分析結(jié)果代入BSA標(biāo)品驗證圖中對ApxⅡ的表達(dá)進(jìn)行定量，使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，ApxⅡ在5 L發(fā)酵罐中的產(chǎn)量為84.99 mg/L；使用CGXⅡ-YT發(fā)酵培養(yǎng)基且在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下培養(yǎng)發(fā)酵ApxⅡ表達(dá)菌株，5 L發(fā)酵罐中ApxⅡ表達(dá)量達(dá)到114.60 mg/L（圖6）。

3" 討論與結(jié)論

由于豬胸膜肺炎傳播力強(qiáng)、危害大，疫苗接種是預(yù)防其暴發(fā)的有效策略。其中Apx為其放線桿菌的毒素，所包含的ApxⅡ是解決豬胸膜肺炎亞單位疫苗的重要環(huán)節(jié)。前人研究多通過大腸桿菌來表達(dá)ApxⅡ，其包涵體情況尤為突出，很大程度上影響了ApxⅡ的分泌表達(dá)。使用谷氨酸棒桿菌進(jìn)行ApxⅡ的表達(dá)，既符合疫苗安全生產(chǎn)的要求，又符合實際生產(chǎn)中對疫苗產(chǎn)量的要求，為進(jìn)行亞單位疫苗生產(chǎn)提供了一個全新的方向。

本研究以谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647為表達(dá)宿主，進(jìn)行ApxⅡ的分泌表達(dá)，實現(xiàn)了ApxⅡ可溶性表達(dá)的能力。在24孔板中通過確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)基碳源和氮源成分、發(fā)酵溫度等發(fā)酵條件，提高了ApxⅡ的表達(dá)量，并在搖瓶中進(jìn)行了放大驗證，隨后在5 L發(fā)酵罐中對培養(yǎng)基分批補(bǔ)料進(jìn)行探索與優(yōu)化，首次將ApxⅡ表達(dá)在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行5 L發(fā)酵罐放大試驗，使用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在5 L發(fā)酵罐中ApxⅡ表達(dá)量為84.99 mg/L，發(fā)酵條件優(yōu)化后使用CGXⅡ-YT培養(yǎng)基，5 L發(fā)酵罐中ApxⅡ表達(dá)量提升到114.60 mg/L。

本研究實現(xiàn)了ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌的高效可溶性表達(dá)，并首次進(jìn)行了放大培養(yǎng)，初步優(yōu)化發(fā)酵條件，為后續(xù)的放大化生產(chǎn)和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：黃克玲）