平涼刺五加葉生藥學研究及其有效成分含量測定

武喜紅 孟鈺忻 高丹 高博 劉少博 陳治郡

摘要 采用性狀鑒別和顯微鑒別法對平涼刺五加植株進行定性分析，并采用高效液相色譜法測定平涼刺五加葉中有效成分的含量。性狀鑒別觀察到平涼刺五加葉的形態多為橢圓狀倒卵形或長圓形，基部闊楔形，邊緣重鋸齒，具有特殊香氣。顯微鑒別顯示，平涼刺五加葉粉末中多含有不定式氣孔、螺紋導管、草酸鈣簇晶、纖維等。刺五加苷B、刺五加苷E的回歸方程具有良好的線性關系，精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于5.00%。3種提取方法中微波超聲協同萃取法有效成分含量最高，刺五加苷B、刺五加苷E含量分別為0.085%、0.358%；微波萃取法次之，含量分別為0.075%、0.328%；超聲輔助提取法含量最低，分別為0.054%、0.222%。

關鍵詞 平涼刺五加葉；生藥學鑒定；高效液相色譜法；有效成分；含量測定

中圖分類號 R284? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）06-0173-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Pharmacognostic Study on the Leaves of Acanthopanax senticosus in Pingliang and the Determination of Its Active Ingredient Content

WU Xi-hong， MENG Yu-xin， GAO Dan et al

（Department of Pharmacy， Gansu Medical College， Pingliang， Gansu 744000）

Abstract Qualitative analysis of A. senticosus plants in Pingliang was conducted using trait identification and microscopic identification methods， and the content of active ingredients in the leaves of A. senticosus in Pingliang was determined using high-performance liquid chromatography.Trait identification showed that the leaves of A. senticosus in Pingliang were mostly elliptic obovate or oblong， the base was broadly wedged， the edge was heavily serrated， and the leaves had special aroma. Microscopic identification showed that the powder of A. senticosus leaves in Pingliang contained many amorphous pores， threaded conduits， calcium oxalate clusters， fibers and so on.The regression equations of eleutheroside B and eleutheroside E had a good linear relationship， and the RSD of precision， stability and repeatability tests were all less than 5.00%.Among the three extraction methods， microwave ultrasonic-assisted extraction had the highest content of active components， the content of eleutheroside B and eleutheroside E was 0.085% and 0.358%， respectively;microwave extraction method followed， with contents of 0.075% and 0.328%， respectively;the ultrasonic-assisted extraction method had the lowest content， which was 0.054% and 0.222%， respectively.

Key words Leaves of Acanthopanax senticosus in Pingliang;Pharmacognostic identification;High performance liquid chromatography;Active ingredient;Content determination

刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.&Maxim.）Harms］，又名一百針、老虎潦子、刺柺棒、五加參、西伯利亞人參，多年生落葉灌木，一、二年生的通常密生刺，少見僅節上生刺或無刺，五葉相交而得名刺五加［1］。《中國藥典》（2020版）記載刺五加的干燥根、根莖或莖可入藥，具有益氣健脾、補腎安神之效［2］，用于脾肺氣虛、體虛乏力、肺腎兩虛、久咳虛喘、腎虛腰膝酸痛、心脾不足、失眠多夢。其莖和果實可制作刺五加酒、飲料；種子可榨油，制作肥皂；嫩葉是時令季節一道美味的山野菜，葉片可加工成刺五加茶［3］。平涼刺五加的有效化學成分主要有黃酮類、苷類、多糖、氨基酸、維生素等［4-7］，《中國藥典》（2020版）規定本品含紫丁香苷（C17H24O9）不得少于0.050%。近年來，刺五加在醫學上需求量越來越大，導致野生刺五加資源過度采挖，造成野生資源嚴重匱乏，現在國家已將其列為三級漸危品種進行保護［8］。作為平涼當地的一種藥食兩用的野生資源，對其質量研究和評價很少，《平涼市“十四五”中醫藥發展規劃》中指出，鼓勵扶持刺五加（五爪子）、楤木（刺椿頭）、百里香等藥食兩用植物的應用和開發，推進山藥、百合、黃花菜等藥菜兩用植物的種植、加工及產業化開發，鼓勵食品生產企業開發藥食（菜）兩用植物相關產品，提高附加產值。筆者從生藥學的角度對平涼刺五加葉的質量和有效成分含量進行研究，為其應用開發提供必要的科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-2030C3D高效液相色譜儀（島津有限公司）；GS-700高速粉碎機（永康市天祺盛世工貿有限公司）；SMART-DM500生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；ISO9001分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；AXTD6M高速離心機（上海趙迪生物科技有限公司）；SHZ-IIIA循環水式多用真空泵（西安莫吉娜儀器制造有限公司）；UWave-2000多功能微波合成萃取儀（上海新儀微波化學科技有限公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純，天津市鑫鉑特化工有限公司）；乙腈（色譜純，天津市鑫鉑特化工有限公司）；磷酸（分析純，天津市鑫鉑特化工有限公司）；刺五加苷B（純度≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院）；刺五加苷E（純度≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 樣品

該試驗樣品于2023年4月份采自平涼市崆峒區峽門溝植物全株，經鑒定為刺五加［Acanthopanaxsenticosus（Rupr.&Maxim.）Harms］。

2 方法與結果

2.1 原植物鑒定

刺五加在平涼各地均有分布，小灌木，5枚小葉，少見3枚，葉柄常疏生細小的荊棘，葉薄，紙質，橢圓狀倒卵形或長圓形，先端漸尖，基部闊楔形，上部粗，暗綠色，葉脈較多，下部淺綠色，邊緣具尖銳的鋸齒，較小的葉柄被褐色的絨毛所覆蓋。根為圓筒狀，多為盤繞狀，長度3.5～12.0 cm，直徑0.3～1.5 cm；根的表面為灰棕色至深棕色，粗糙，具細微縱向凹痕及褶皺，表皮較薄，偶爾會脫落，脫落部分為灰黃色［7］。質地堅硬，橫切面呈黃白色，呈纖維狀（圖1）。根莖粗1.4～4.2 cm，為節狀、圓形、橢圓形。有特殊香味，略辛辣、苦澀。莖上的刺并不是固定的，一年生者刺細密發紅，兩年生者刺褐色，然后慢慢從莖上脫落，之后刺逐漸脫落，顯環狀尖刺痕跡。

2.2 性狀鑒別

將采集樣品曬干，浸泡在溫水中，待葉片完

全舒展后，取出晾干表面水分，平置于純色背景板上，用手機進行拍照記錄并描述。藥材常纏繞結團，呈淡綠色或淡褐色，展開后5～7 cm；莖細，直徑0.5～1.0 mm；掌狀復葉，葉互生，具葉柄，葉片卵形，長4～5 cm，寬2～3 cm，上表面多為深綠色（圖2a），下表面為淡綠色（圖2b），先端急尖或漸尖，基部楔形，具有淡黃綠色的叉狀葉脈，葉柄0.8～1.5 cm，基部呈抱莖鞘（圖2c）。

2.3 粉末鑒別

取干燥葉粉碎，過3號篩，取少量置載玻片上，滴加水合氯醛，加熱透化，置顯微鏡下觀察，結果發現（圖3～4），導管多為螺紋導管，直徑8～24 μm；可見不定式氣孔，副衛細胞3～4個；草酸鈣簇晶較多，呈黃棕色，棱角較鈍［9-10］。

2.4 刺五加葉有效成分含量提取

2.4.1

HPLC方法建立。選擇C18反相色譜柱；以乙腈-0.1％磷酸水溶液（20∶80）為流動相，選擇乙腈作為流動相，因為同條件下乙腈-水的分離效果優于甲醇-水的分離效果，加入一定量的酸性溶液是因為其可以有效改善峰型，防止拖尾。柱溫設置為30 ℃，色譜流速為1.0 mL/min，刺五加苷B紫外最大吸收峰為265 nm，所以在265 nm處檢測刺五加苷B，同理刺五加苷E在210 nm處進行檢測［11-13］。

2.4.2 標準溶液的制備。分別精密稱取20.00 mg的刺五加苷B、刺五加苷E的對照品，使用50%色譜甲醇，對其進行溶解，并最終置于10 mL容量瓶內定容，得到濃度為2 mg/mL的標準品儲備溶液。之后使用50%色譜甲醇將標準品儲備液稀釋成所需濃度梯度的標準溶液，并通過0.45 μm有機濾膜過濾，制備好標準品后將其置于冰箱中冷藏備用［14］。

2.4.3 供試品溶液的制備。

（1）微波萃取法。將采集到的刺五加葉曬干后置于高速粉碎機中充分粉碎，過40目篩，樣品保存在陰涼通風處，備用。精密稱取刺五加葉粉末5.086 0 g置于250 mL微波萃取器中，加入100 mL甲醇，放置于微波萃取儀中進行提取，微波萃取功率設置為250 W，溫度設置為60 ℃，時間15 min。

萃取結束后進行抽濾，抽濾后，取部分濾液置于離心管中，放入離心機，6 000 r/min離心15 min。最后取上清液，使用微孔濾膜（0.45 μm）過濾所得溶液，得到樣品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

（2）超聲輔助提取法。精密稱取刺五加葉粉末5.015 8 g置于250 mL微波萃取器中，加入100 mL甲醇，將錐形瓶放置于微波萃取儀中進行超聲提取，超聲功率設置為400 W，溫度同樣設置為60 ℃，時間15 min。提取結束后進行抽濾，取部分濾液置于離心管中，放入離心機，6 000 r/min 離心15 min。最后取上清液，使用微孔濾膜（0.45 μm）過濾所得溶液，得到樣品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

（3）微波超聲協同萃取法。精密稱取刺五加葉粉末5.004 6 g置于250 mL微波萃取器中，加入100 mL甲醇，放置于微波萃取儀中微波超聲協同萃取，提取功率設置為250 W，提取溫度為60 ℃，超聲功率400 W，時間15 min。提取結束后進行抽濾，取部分濾液置于離心管中，放入離心機，6 000 r/min 離心15 min。最后取上清液，使用微孔濾膜（0.45 μm）過濾所得溶液，得到樣品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.4.4

刺五加苷B、刺五加苷E的含量測定。按照“2.4.3”方法完成刺五加葉中有效成分提取，然后利用“2.4.1”所建立的HPLC多組分檢測方法完成對刺五加苷B、刺五加苷E定性定量測定分析。刺五加苷B、刺五加苷E對照品和供試品色譜圖見圖5～6。觀察圖譜，比較各對照品保留時間發現，此

法專屬性強。

選擇微波萃取法、超聲輔助提取法和微波超聲協同萃取法對平涼刺五加葉中刺五加苷B、刺五加苷E進行提取，其含量如表2所示。從表2可以看出，微波超聲協同萃取法有效成分含量最高，微波萃取法次之，超聲輔助提取法含量最低。

2.4.5 方法學驗證。

2.4.5.1 重現性。將刺五加苷B、刺五加苷E這2種對照品溶液重復進樣6次，記錄每種被分析物的色譜峰面積和液相保留時間，并計算其相對標準偏差（RSD），結果如表3所示。從表3可以看出，刺五加苷B、刺五加苷E峰面積的RSD分別為5.137%、3.261%，刺五加苷B、刺五加苷E保留時間的RSD分別為0.81%、0.61%，表明該試驗所建立的分析方法重現性良好。

2.4.5.2

精密度。該試驗選擇日間精密度檢測，日間精密度指的是在24 h內將每個待分析的樣品重復進樣6次，并最終計算每種分析物的峰面積和保留時間的RSD。通過計算得出刺五加苷B、刺五加苷E的日間精密度分別為4.42%、3.89%，均小于5.00%，表明該分析方法具有良好的精密度。

2.4.5.3

穩定性。在“2.4.1”色譜條件下，取已經提取好的樣品溶液，在12、14、16、18、20、22 h各進樣1次，測定刺五加苷B、刺五加苷E峰面積，計算刺五加苷B、刺五加苷E的RSD分別為4.67%、4.89%，均小于5.00%，表明供試品溶液在22 h內穩定。

2.4.5.4

標準曲線的繪制。使用分析天平精密量取刺五加苷B、刺五加苷E對照品，用色譜甲醇配制成50%的甲醇溶液，備用。用50%的甲醇將儲備溶液稀釋成一系列濃度梯度的對照品測試溶液，依次通過高效液相色譜對其進行檢測，每個測試濃度都重復3次試驗，并記錄相應數據，最終以刺五加苷B、刺五加苷E對照品的濃度作為橫坐標、峰面積作為縱坐標繪制對照品的標準曲線（圖7），得出其線性回歸方程（表4）。刺五加苷B、刺五加苷E線性回歸方程的R2均大于0.998，表明對于2種目標分析物的回歸方程具有良好的線性關系。以上試驗結果充分表明該試驗所建立的對于刺五加苷B、刺五加苷E的分析方法準確率較高。

3 結論

該研究以平涼刺五加為研究對象，對該植株進行生藥學的性狀和顯微鑒別，該植株葉片多為橢圓狀倒卵形或長圓形，先端漸尖，基部闊楔形，邊緣具尖銳的鋸齒，葉上面粗糙、深綠色，葉脈多，下面淡綠色；小葉柄有棕色短柔毛，葉具有特殊香氣。顯微鑒別觀察到刺五加葉粉末中含有不定式氣孔，導管多為螺紋狀、草酸鈣簇晶但棱角較鈍，含有較多纖維等。選擇微波萃取法、超聲輔助提取法和微波超聲協同萃取法進行刺五加苷B、刺五加苷E提取，微波超聲協同萃取法有效成分含量最高，利用高效液相色譜法測定平涼刺五加葉中刺五加苷B、刺五加苷E含量分別為0.085%、0.358%；微波萃取法次之，含量分別為0.075%、0.328%；超聲輔助提取法含量最低，分別為0.054%、0.222%。

該試驗借鑒其他文獻的檢測方法，并在其檢測方法基礎上進行了一定的優化，最終所建立的高效液相色譜分析方法可以檢測刺五加葉中的2種苷類有效成分。該方法穩定性強、精密度高、重現性好，適合于刺五加葉中刺五加苷B、刺五加苷E這2種目標化合物的定性定量分析檢測，研究結果可為當地產刺五加的資源開發利用提供一定的科學理論依據。

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