葡萄籽原花青素調控Nrf2/HO-1通路減弱多柔比星誘導的心臟毒性

吳敏 瞿怡倩 黃蘇敏

摘要 目的：觀察葡萄籽原花青素對多柔比星（DOX）誘導的心臟毒性以及核因子E2相關基因（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）通路的作用。方法：通過DOX構建小鼠急性心臟毒性模型，本實驗分為對照組（正常小鼠）、葡萄籽原花青素組、DOX組、DOX＋葡萄籽原花青素組、DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組。超聲心動圖檢查小鼠心功能；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠心肌病理改變；原位末端標記測定法（TUNEL）檢測小鼠心肌細胞凋亡情況；酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）水平；試劑盒檢測心肌組織中活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；蛋白質免疫印跡法（Western Blot）測定Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平。結果：與對照組比較，DOX組小鼠心肌損傷加重，左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD），血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平及心肌組織ROS、MDA及心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05），射血分數（EF）、短軸縮短分數（FS）、心肌組織SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素組小鼠心肌損傷，LVESD、LVEDD、EF、FS水平，血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平，心肌組織ROS、MDA、SOD、Nrf2、HO-1蛋白，心肌細胞凋亡率差異均無統計學意義（P＞0.05）。與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青組小鼠心肌損傷減輕，LVESD、LVEDD降低，血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平降低，心肌組織ROS、MDA、心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05），EF、FS及心肌組織SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠心肌損傷加重，LVESD、LVEDD及血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平、心肌組織ROS、MDA、心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05），EF、FS、心肌組織SOD、Nrf2、HO-1蛋白水平降低（P＜0.05）。結論：葡萄籽原花青素可能通過激活Nrf2/HO-1通路，對DOX誘導的心臟毒性小鼠發揮保護作用。

關鍵詞 葡萄籽原花青素；核因子E2相關基因；血紅素加氧酶1；多柔比星；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.011

Grape Seed Proanthocyanidins Attenuates Doxorubicin-induced Cardiotoxicity by Regulating Nrf2/HO-1 Pathway

WU Min，QU Yiqian，HUANG Sumin

Nankai Traditional Chinese Medicine Hospital， Tianjin 300102， China， E-mail： 975350882@qq.com

Abstract Objective：To observe grape seed proanthocyanidins could alleviate doxorubicin（DOX）-induced cardiotoxicity and the role of nuclear factor E2-related gene（Nrf2）/heme oxygenase-1（HO-1） pathway on it.Methods：The mice model with acute cardiotoxicity was established by DOX，and the experiment was divided into the control group（normal mice），grape seed proanthocyanidin group，DOX group，DOX＋grape seed proanthocyanidin group，DOX＋grape seed proanthocyanidin＋ML385 group.Echocardiography was used to detect cardiac function in mice;hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of myocardial cells in mice;the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） assay was used to detect the apoptosis of cardiomyocytes;enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to measure serum creatine kinase isoenzyme（CK-MB），interleukin-6（IL-6），and interleukin-1β（IL-1β） levels;The kit was used to detect reactive oxygen species（ROS），malondialdehyde（MDA），and superoxide dismutase（SOD） levels in myocardial tissue;Western Blot was used to determine the expression levels of Nrf2/HO-1 pathway proteins.Results： Compared with the control group，the myocardial injury of the mice in the DOX group aggravated;the left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end-systolic diameter（LVESD），serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，myocardial cell apoptosis rate increased（P＜0.05）;ejection fraction（EF），fractional shortening（FS），myocardial tissue SOD，Nrf2，and HO-1 protein levels decreased（P＜0.05）.In the seed proanthocyanidin group，the difference in myocardial injury，LVESD，LVEDD，EF，FS，serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，SOD，Nrf2，HO-1 protein，and cardiomyocyte apoptosis rate was not statistically significant（P＞0.05）.Compared with the DOX group，the myocardial injury of the mice in the DOX＋grape seed proanthocyanidin group alleviated;LVESD，LVEDD，serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，and myocardial cell apoptosis rate reduced（P＜0.05）;EF，FS，protein levels of SOD，Nrf2，and HO-1 in myocardial tissue increased（P＜0.05）.Compared with the DOX＋ grape seed proanthocyanidin group，myocardial injury in the DOX＋ grape seed proanthocyanidin＋ML385 group aggravated;LVESD，LVEDD，Serum CK-MB，IL-6，IL-1β levels，myocardial tissue ROS，MDA，and myocardial cell apoptosis rate increased（P＜0.05）;EF，FS，myocardial tissue SOD，Nrf2，and HO-1 protein levels decreased（P＜0.05）.Conclusion：Grape seed proanthocyanidins may protect against DOX^-induced cardiotoxicity in mice by activating the Nrf2/HO-1 pathway.

Keywords grape seed proanthocyanidins;nuclear factor E2 related gene;heme oxygenase 1;doxorubicin;experimental study

基金項目 天津市科技發展計劃項目（No.2018-HBCD-18）

作者單位 1.天津市南開區中醫醫院（天津 300102），E-mail：975350882@qq.com；2.上海市普陀區真如鎮街道社區衛生服務中心

引用信息 吳敏，瞿怡倩，黃蘇敏.葡萄籽原花青素調控Nrf2/HO-1通路減弱多柔比星誘導的心臟毒性［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（3）：464-469.

多柔比星（DOX）屬于蒽環類藥物，是應用較為廣泛的化療藥物，對腫瘤組織有強大的殺傷作用，但其在殺傷腫瘤的同時也會對正常組織造成傷害，心臟是首當其沖的器官^［1-2］，保留DOX抗腫瘤作用并降低其心臟毒性是臨床中亟待解決的問題之一。DOX造成心臟毒性的機制較為復雜，其通過提升心肌細胞氧化應激水平造成心肌細胞凋亡可能是原因之一^［3］。核因子E2相關基因（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）是在細胞氧化應激中發揮作用的關鍵通路之一，虎杖苷可通過激活此通路抑制氧化應激誘導的心肌細胞損傷^［4］；異甘草素可通過調控此通路抑制活性氧（ROS）的產生，對阿霉素誘導的胰腺炎發揮保護作用^［5］。因此，本研究從Nrf2/HO-1氧化應激通路入手尋求降低DOX所致心臟毒性的有效藥物。葡萄籽中含大量原花青素，原花青素素是多酚類物質，可有效清除氧自由基，在心腦血管疾病中發揮防控作用，如葡萄籽原花青素可保護嗜鉻神經瘤細胞（PCI2）免受過氧化氫誘導的損傷^［6］；還可通過降低氧化應激發揮對雙酚A誘導的急性神經炎癥雄性大鼠的神經保護作用^［7］。本研究通過構建DOX誘導的急性心臟毒性小鼠模型，探究葡萄籽原花青素對其的保護作用以及相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

近交品系實驗鼠（C57BL/6）小鼠60只，體質量20～25 g，購自吉林大學，許可證號：SYXK（吉）2021-0003，本研究經本院動物倫理委員會批準。葡萄籽原花青素（Y70767）購自上海源葉；Nrf2通路抑制劑ML385（S8790）購自selleck；肌酸激酶同工酶（CK-MB，ml037723）、白細胞介素-6（IL-6，ml063159）、白細胞介素-1β（IL-1β，ml301814）的酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自上海酶聯；ROS（S0033S）、丙二醛（MDA，S0131S）、超氧化物歧化酶（SOD，S0101S）試劑盒購自上海碧云天；Nrf2（ab62352）、HO-1（ab52947）、GAPDH一抗（ab9485）、山羊抗兔IgG二抗（ab205718）購自美國Abcam。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的構建

給小鼠腹腔注射2.5 mg/kg的DOX，2周內注射6次，合計劑量為15 mg/kg，誘導心臟毒性模型^［8］。

1.2.2 實驗分組及處理情況

60只C57BL/6小鼠隨機分為對照組（正常喂養小鼠，飲食、飲水自由）、DOX組、葡萄籽原花青素（500 mg/kg）組^［9］、DOX＋葡萄籽原花青素組（造模成功后給予500 mg/kg的葡萄籽原花青素）、DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組（ML385劑量30 mg/kg）^［10］，每組12只。對照組和葡萄籽原花青素組給予腹腔注射10 mL/kg生理鹽水，其余各組腹腔注射2.5 mg/kg DOX，2周內注射6次構建心臟毒性模型；其中葡萄籽原花青素組、DOX＋葡萄籽原花青素組每日給予500 mg/kg葡萄籽原花青素灌胃，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組每日灌胃500 mg/kg葡萄籽原花青素的同時腹腔注射30 mg/kg ML385，連續干預14 d。給藥結束后，超聲心動圖檢測各組小鼠心功能指標左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、射血分數（EF）、短軸縮短分數（FS）。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平

各組小鼠心功能指標檢測結束后，收集小鼠靜脈血血清，按照血清CK-MB、IL-6、IL-1β各自試劑盒說明書進行操作，測定各項指標值。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測小鼠心肌組織病理變化

取血完成后斷頭處死小鼠，分離小鼠心臟，修剪后制備石蠟切片，參照HE染色試劑盒說明書處理，封片后顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理變化。

1.2.5 原位末端轉移酶標記測定法（TUNEL）檢測小鼠心肌細胞凋亡

收集制備的石蠟切片，脫蠟后通過TUNEL試劑盒進行TUNEL染色，并顯微鏡下計數，計算小鼠心肌細胞凋亡率，凋亡率（%）＝凋亡細胞（黃褐色）數/總細胞數×100%。

1.2.6 小鼠心肌組織ROS、MDA、SOD水平檢測

取部分心臟組織，稱量后制備10%心肌組織勻漿，離心（3 000 r/min，15 min）后收集上清液，按照試劑盒說明書測定小鼠心肌組織中ROS、MDA、SOD水平。

1.2.7 蛋白質免疫印跡法（Western Blot）檢測Nrf2/HO-1通路蛋白

取部分小鼠心臟組織，勻漿后離心（12 000 r/min，15 min）得上清液，聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，封閉，加入稀釋一抗Nrf2、HO-1（稀釋均為1∶1 000，內參GAPDH稀釋比為1∶5 000），4 ℃孵育24 h后，添加1∶5 000稀釋比的二抗，用增強型化學發現試劑（ECL）顯色液顯色，分析Nrf2、HO-1蛋白表達量。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件分析數據，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x^-±s）表示，組間比較進行單因素方差分析，進一步兩兩組間比較行LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠心功能的改善

與對照組比較，DOX組小鼠LVESD、LVEDD升高（P＜0.05），EF、FS降低（P＜0.05）；葡萄籽原花青素組LVESD、LVEDD、EF、FS差異無統計學意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠LVESD、LVEDD降低（P＜0.05），EF、FS升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠LVESD、LVEDD升高（P＜0.05），EF、FS降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平的影響

與對照組比較，DOX組小鼠血清CK-MB、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素組CK-MB、IL-6、IL-1β水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平降低（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠CK-MB、IL-6、IL-1β水平升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠ROS、MDA、SOD指標的影響

與對照組比較，DOX組小鼠ROS、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05），葡萄籽原花青素組ROS、MDA、SOD水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠ROS、MDA水平降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠ROS、MDA水平升高（P＜0.05），SOD水平降低（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠心肌病理的改善

對照組心肌細胞排列正常；DOX組心肌細胞存在水腫、破裂，細胞排列紊亂；葡萄籽原花青素組無明顯變化；葡萄籽原花青素處理可改善DOX組小鼠心肌損傷程度；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組心肌損傷程度加深。詳見圖1。

2.5 葡萄籽原花青素對心臟毒性小鼠心肌細胞凋亡的影響

與對照組比較，DOX組小鼠心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05），葡萄籽原花青素組心肌細胞凋亡差異無統計學意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6 葡萄籽原花青素激活心臟毒性小鼠心肌組織Nrf2/HO-1通路

與對照組比較，DOX組小鼠心肌組織表達Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低（P＜0.05），葡萄籽原花青素組心肌組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與DOX組比較，DOX＋葡萄籽原花青素組小鼠心肌組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與DOX＋葡萄籽原花青素組比較，DOX＋葡萄籽原花青素＋ML385組小鼠心肌組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低（P＜0.05）。詳見圖3、表5。

3 討 論

DOX引發的心臟毒性是阻礙其發揮抗腫瘤作用的原因，探究其引發心臟毒性的機制并尋求有效防治藥物是研究方向。DOX誘導的心臟毒性機制包括對心肌細胞肌小節結構的破壞^［11］、氧化應激導致的心肌細胞凋亡^［12］、自噬^［13］等。

本研究從氧化應激角度進行探討，通過腹腔注射DOX構建小鼠急性心臟毒性模型，小鼠LVESD、LVEDD明顯升高，EF、FS明顯降低，即模型小鼠心功能下降；CK-MB、IL-6、IL-1β水平較正常小鼠明顯升高，提示模型小鼠心肌損傷、炎癥水平升高；ROS、MDA水平的升高與SOD水平的下降提示小鼠心肌氧化應激水平升高；HE染色與TUNEL染色結果顯示模型小鼠心肌水腫、破裂，細胞排列紊亂、凋亡率升高，心臟損傷加劇，由此表明，DOX可引發心臟毒性。

DOX產生的副作用為產生過量細胞內ROS，過量的氧化劑（自由基）在體內游離會破壞DNA與組織，產生心臟毒性，但ROS反映的下游分子信號轉導發揮著更關鍵的作用^［14］。Nrf2是內源性抗氧化劑，可與抗氧化原件結合，激活抗氧化酶的基因表達，其受ROS調控，Nrf2是HO-1的誘導劑之一，在氧化應激狀態下可發揮對HO-1的調控作用^［15］。正常狀態下Nrf2與Keap1相互作用保持低轉錄狀態活性，但受ROS等氧化應激刺激下解離，進入細胞核，啟動HO-1等抗氧化基因的轉錄^［16］。姜黃素可劑量依賴性地減少人鼻腔成纖維細胞ROS的生成，并促進Nrf2/HO-1通路激活^［17］；沒食子酸通過激活彈性蛋白酶誘導的肺氣腫大鼠Nrf2/HO-1/核轉錄因子（NF）-κB通路，抑制氧化應激與炎癥^［18］；丁酸可通過激活Nrf2通路激活抗氧化途徑減輕大鼠神經功能缺損^［19］；激活Nrf2/HO-1通路可保護缺氧誘導的心肌組織損傷^［20］。以上研究均說明Nrf2/HO-1通路在抗氧化應激損傷中發揮積極作用。

原花青素是一種天然抗氧化劑，葡萄籽中原花青素含量豐富，是由兒茶素、沒食子酸、表兒茶素組成的多聚體，其多羥基結構使其擁有高抗氧化作用。方歡樂等^［21］研究顯示，葡萄籽原花青素可降低D-半乳糖致衰老模型肝組織、血液、皮膚組織中MDA水平，并提高SOD水平，對大鼠肝臟的病理狀態有改善作用；云少君等^［22］研究顯示原花青素對鐵過量引起的大鼠腎臟鐵超載、氧化損傷及細胞凋亡發揮保護作用；本研究中，原花青素可改善DOX引發的心功能損傷，降低CK-MB、IL-6、IL-1β、ROS、MDA水平、心肌細胞凋亡率，而原花青素對正常小鼠心功能、氧化應激、心肌酶譜等無作用，提示原花青素可改善DOX引發的小鼠氧化應激、炎癥反應、心肌損傷。DOX誘導的心肌組織Nrf2、HO-1水平降低，經原花青素處理后小鼠心肌組織Nrf2、HO-1水平升高；提示原花青素對DOX誘導的小鼠心臟毒性的保護作用，可能與激活Nrf2/HO-1通路有關。在原花青素處理基礎上增添Nrf2抑制劑，抑制Nrf2激活，此心臟毒性的保護作用被削弱，進一步提示葡萄籽原花青素可能通過激活Nrf2/HO-1通路發揮對DOX誘導的心臟毒性小鼠發揮保護作用。

綜上所述，葡萄籽原花青素可能通過激活Nrf2/HO-1通路，對DOX誘導的心臟毒性小鼠發揮保護作用，但本研究仍存在一定局限性，有待今后研究補充體外實驗進一步驗證。

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（收稿日期：2022-03-28）

（本文編輯 王雅潔）