德氏乳桿菌KY20 胞外多糖對C57BL/6 小鼠肥胖的預(yù)防作用

張?zhí)煊睿昃矗荑w崇杰，江雨男，秦琳琳，孫偲，郝力壯，陳勉，王楠*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,教育部工業(yè)發(fā)酵微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457；2.青海百分牛生物科技有限公司,青海西寧 810016；3.青海大學(xué)青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810016；4.山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東濟(jì)南 250101）

近年來,我國肥胖和Ⅱ型糖尿病的發(fā)病率快速上升。據(jù)2020 年國家衛(wèi)健委公布的數(shù)據(jù),18 歲以上成年人肥胖率達(dá)到16.4%[1-2],2019 年,在中國非傳染性疾病相關(guān)的死亡病例中,由超重和肥胖導(dǎo)致的占11.1%[3]。目前,緩解肥胖的手段主要包括飲食調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)、手術(shù)治療和藥物調(diào)節(jié)。但手術(shù)治療和藥物調(diào)節(jié)存在安全性、副作用等問題,所以僅適用于少數(shù)患者[4-5],相對而言人們更愿意接受健康合理的飲食調(diào)節(jié)方式。近年來,益生菌及其后生元對健康的調(diào)節(jié)作用日益受到人們的關(guān)注,益生菌的干預(yù)可以有效改善肥胖,并具有公認(rèn)的安全性。

已有大量研究證實(shí)益生菌可以緩解肥胖[6]、降低胰島素抵抗[7]、減輕炎癥[8],對肥胖及其并發(fā)癥具有較好的改善作用[9-10],其主要機(jī)制包括抑制膽固醇合成酶活性、抑制食欲進(jìn)而減少攝入高熱量食物、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道屏障、降低炎癥因子水平、提高胰島素敏感性等。目前已有多種乳酸菌菌株表現(xiàn)出較為明顯的抗肥胖作用。Zarrati 等[11]以76 名健康超重和肥胖個(gè)體為研究對象,發(fā)現(xiàn)益生菌（嗜酸乳桿菌La5、雙歧桿菌BB12 和干酪乳桿菌DN001）酸奶及減肥飲食干預(yù)會(huì)明顯降低體質(zhì)量指數(shù)和脂肪百分比。補(bǔ)充合生元（含有嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌加菊粉）也可以為超重或肥胖的受試者帶來許多健康益處,包括改善甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、體重、壓力、焦慮和抑郁[12]。干酪乳桿菌IMV B-7280[13]、發(fā)酵乳桿菌KUB-D18[14]等均已被證實(shí)具有降膽固醇、抑制肥胖的效果。Hallajzadeh 等[15]證實(shí)德氏乳桿菌PTCC1057 能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖水平。

乳酸菌的胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）是乳酸菌生長代謝過程中分泌的一類糖類化合物,具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善腸道菌群等多種功效[16-17]。除了上述研究較多的功效,也有少量研究證實(shí)乳酸菌的胞外多糖可以改善肥胖。Zhang 等[18]研究表明,從鼠李糖乳桿菌GG 中分離的EPS 能夠有效降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟三酰甘油和膽固醇水平,抑制脂肪形成。相對而言,德氏乳桿菌胞外多糖在抗肥胖方面的研究較少,因此,對其EPS 降脂減肥功效的研究具有重要意義。本課題組前期從河套地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到一株德氏乳桿菌KY20,發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性,但菌株及其EPS 是否具有降脂減肥的作用尚未可知。因此本研究通過分離提取KY20 的胞外多糖,探究KY20 及其胞外多糖對肥胖的抑制作用,旨在為預(yù)防治療肥胖及其相關(guān)疾病提供新的研究思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與動(dòng)物

自河套地區(qū)分離的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的德氏乳桿菌保加利亞亞種KY20:保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,CGMCC 編號(hào)20084；無特定病原體（specific pathogen free,SPF）動(dòng)物C57BL/6J 雄性小鼠[6～8 周齡,許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006]:北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限技術(shù)公司；動(dòng)物高脂飼料（D12492）:美國Research Diets 公司。

1.1.2 主要試劑

MRS 液體培養(yǎng)基:北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、無水乙醇（均為分析純）:天津市江天化工技術(shù)有限公司；總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器與設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16C 型）:上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；厭氧培養(yǎng)箱（SPX-150 型）:湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅲ）:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；多功能酶標(biāo)儀（iD3）:美谷分子儀器（上海）有限公司；血糖儀、血糖試紙（優(yōu)易GM501）:三諾生物傳感股份有限公司；氣相色譜儀（GC-7890）:美國Agilent 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker Vetex 70 FT-IR）:德國布魯克公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的生長曲線及耐受性的測定

1.2.1.1 菌株的生長曲線

將活化兩次的KY20 接種于MRS 液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每隔1 h 取樣1 次,并在波長600 nm 處測定吸光值,繪制菌株的生長曲線。

1.2.1.2 耐酸性、耐膽鹽能力測定

耐酸能力測定:將KY20 接種于pH 值為1.0、2.0、3.0、4.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中；耐膽鹽能力測定:將KY20 接種于不同膽鹽濃度（0.1%、0.2%、0.3%）的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中4 h,通過測量490 nm 處的吸光值,按照下列公式計(jì)算存活率。

式中:ɑ為存活率,%；b為實(shí)驗(yàn)組吸光值；c為對照組的吸光值。

1.2.1.3 耐藥性測定

采用K-B 紙片擴(kuò)散法,將37 ℃倒置培養(yǎng)24 h 后的平板取出測定其抑菌圈直徑。

1.2.2 胞外多糖的提取、純化及結(jié)構(gòu)分析

1.2.2.1 胞外多糖的提取和純化

KY20 培養(yǎng)過夜后收集菌液煮沸,除去菌體沉淀,將發(fā)酵液在8 000 r/min、4 ℃離心20 min,收集上清液,蒸發(fā)濃縮；三氯乙酸法除蛋白,水提醇沉法提取多糖,透析后真空冷凍即為胞外多糖粗品。將胞外多糖粗品過DEAE-52 陰離子交換柱,分別收集0～0.5 mol/L NaCl 洗脫溶液,其中以0.1 mol/L NaCl 洗脫的多糖為主,收集并合并單一峰組分,去離子水透析至無Cl-檢出并冷凍干燥。

1.2.2.2 胞外多糖的主要成分測定

參考王曉楠[19]的方法,通過苯酚-硫酸法測定多糖含量,間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量；參考仇小妹等[20]的方法,通過Folin 法測定總酚含量。

1.2.2.3 胞外多糖的分子量測定

使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）對多糖的分子量進(jìn)行測定,色譜柱為TSKgel G4000PWXL（10μm,7.8 mm×300 mm）,進(jìn)樣量為20μL,流速為0.5 mL/min,柱溫為38 ℃。采用不同分子量的D-葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-31 617x+30.684,根據(jù)出峰時(shí)間計(jì)算樣品的相對分子質(zhì)量。

1.2.2.4 紫外光譜測定

用雙蒸水配制0.5 mg/mL 多糖溶液,用0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行紫外光譜掃描（波長230～380 nm）,樣品流速為0.5 mL/min。

1.2.2.5 傅里葉變換紅外光譜測定

將干燥的EPS（2 mg）用溴化鉀粉末（200 mg）研磨并壓制成片劑,然后使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 小鼠分組與飼養(yǎng)

C57BL/6J 小鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為6 組,分別為正常組、模型組、KY20 組、EPS 低劑量組、EPS 中劑量組、EPS 高劑量組。正常組為普通飼料喂養(yǎng),模型組、KY20 組、EPS 組均給予高脂飼料喂養(yǎng),KY20 組按照1×108CFU/次給予KY20,EPS 低、中、高組分別按50、100 mg/kg 和200 mg/kg 給予KY20 胞外多糖,各組均隔日灌胃,連續(xù)12 周。

1.2.3.2 葡萄糖耐量（glucose tolerant,GTT）的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,按2 g/kg 葡萄糖劑量對小鼠進(jìn)行腹腔注射,在不同時(shí)間對小鼠進(jìn)行尾靜脈取血,測量小鼠的血糖值并計(jì)算曲線下面積（area under curve,AUC）,AUC 的計(jì)算公式如下。

式中:A為AUC,h·（mmol/L）；c0min、c15min、c30min、c60min、c120min為不同時(shí)間的血糖值,mmol/L。

1.2.3.3 胰島素耐量（insulin tolerant,ITT）的測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,按照0.75 U/kg 的胰島素劑量對小鼠進(jìn)行腹腔注射,在不同時(shí)間測量小鼠的血糖值。按照

1.2.3.2 公式計(jì)算曲線下面積。

1.2.3.4 胰島素抵抗指數(shù)測定

對小鼠進(jìn)行尾尖取血并用血糖儀測量空腹血糖,采用試劑盒檢測小鼠血清中的胰島素含量,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）。HOMA-IR 計(jì)算公式如下。

式中:z為胰島素抵抗指數(shù)；m為胰島素含量,mmol/L；n為空腹血糖值,mmol/L；22.5 為校正因子。

1.2.3.5 樣品采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對小鼠進(jìn)行眼球取血,收集血清于-20 ℃保存；取小鼠的肝臟、腎臟、胰腺、脾臟進(jìn)行稱重,并將肝臟、脂肪固定于多聚甲醛；取皮下、附睪、肩胛脂肪組織并稱重,取盲腸內(nèi)容物于-80 ℃保存。

1.2.3.6 組織病理學(xué)分析

取小鼠的組織置于固定液中,使組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)變性凝固,蒸餾水清洗組織表面的固定液后,分別用不同濃度的乙醇浸泡,逐漸脫去組織中的水分；然后用體積比為1∶1 的無水乙醇與二甲苯溶液、二甲苯溶液分別浸泡30 min,以二甲苯替換出組織中的乙醇；將透明的組織用石蠟液體浸滲3 次,每次1 h,用包埋框包埋,固定好后切成3μm 薄片,并在恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)中37.5 ℃恒溫下進(jìn)行烤片2 h；用二甲苯脫去切片中的石蠟后,不同濃度的乙醇處理除去切片中的二甲苯,蒸餾水浸泡1 min,自然風(fēng)干,磷酸鹽緩沖液清洗3 次后進(jìn)行染色；蘇木素染色3 min；自來水洗片2 min；用1%鹽酸酒精溶液分化；用2% 伊紅溶液染色3 min；蒸餾水沖洗2 min,重復(fù)3 次；無水乙醇脫水,二甲苯透明；中性樹膠封片；最后在正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3.7 血脂指標(biāo)測定

將血清放置冰上解凍后,按照相應(yīng)試劑盒的操作步驟,采用多功能酶標(biāo)儀測定血清中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量。

1.2.3.8 短鏈脂肪酸（short chain fatty acid,SCFAs）含量的測定

取小鼠盲腸內(nèi)容物,溶于蒸餾水中,渦旋混勻,4 ℃、12 000 r/min 離心取上清液加入100μL 10%硫酸溶液,渦旋混勻后加入1 mL 乙酸乙酯繼續(xù)渦旋4 ℃離心制備樣品。采用的色譜柱及相應(yīng)進(jìn)樣條件:色譜柱為HP-5（30 m×320μm×0.25μm）,進(jìn)樣量為1μL,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,分流比為1∶1,柱流速為2 mL/min,柱溫:初始柱溫為90 ℃,持續(xù)6 min,以10 ℃/min 升至200 ℃,并保持6 min。載氣的流速為2 mL/min。（氫）火焰離子化檢測器檢測器溫度為250 ℃,氫氣和空氣的流量分別為30 mL/min 和300 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用軟件Graphpad prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用one-way ANOVA 分析,P<0.05 時(shí),表示與比較組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株KY20 的生長與益生特性

2.1.1 菌株KY20 的生長曲線

德氏乳桿菌KY20 的生長曲線見圖1。

圖1 德氏乳桿菌KY20 的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus delbrueckii KY20

由圖1 可知,德氏乳桿菌KY20 在4 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期,9 h 進(jìn)入平衡期,達(dá)到最大生長速率。

2.1.2 菌株KY20 耐受性結(jié)果分析

菌株KY20 的耐受性如圖2 所示。

圖2 德氏乳桿菌KY20 的耐受性Fig.2 Tolerance of Lactobacillus delbrueckii KY20

由圖2A 可知,菌株KY20 在pH1、pH2、pH3 條件下培養(yǎng)4 h 后存活率分別為（44.26±1.21）%、（49.18±1.42）%和（50.01±0.64）%,而pH4 條件下存活率可達(dá)（81.54±1.75）%。由圖2B 可知,將菌株KY20 在膽鹽濃度為0.10%、0.20% 和0.30% 的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h 后,存活率分別為（84.08±4.67）%、（59.10±0.95）%和（52.86±1.19）%。因此,德氏乳桿菌KY20 展示出較強(qiáng)的耐酸、膽鹽耐受能力。

2.1.3 菌株KY20 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

德氏乳桿菌KY20 的藥物敏感性見表1。

表1 德氏乳桿菌KY20 的藥物敏感性Table 1 Antibiotic susceptibility of Lactobacillus delbrueckii KY20

由表1 可知,德氏乳桿菌KY20 對青霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、利福平敏感；對鏈霉素和紅霉素中度敏感；而對亞胺培南、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、頭孢噻吩、頭孢他啶、頭孢噻肟、萬古霉素均不敏感。

2.2 菌株KY20 胞外多糖提取分離與性質(zhì)鑒定

2.2.1 菌株KY20 胞外多糖提取分離

EPS 洗脫曲線及HPLC 分析見圖3。

圖3 EPS 洗脫曲線及HPLC 分析Fig.3 Elution curve and HPLC analysis of exopolysaccharide

由圖3 可知,經(jīng)DEAE-52 陰離子交換樹脂進(jìn)行不同濃度NaCl 溶液洗脫后,德氏乳桿菌KY20 洗脫峰以0.1mol/L NaCl 洗脫液為主,說明粗多糖中以酸性多糖為主。將0.1mol/L NaCl 溶液洗脫的多糖進(jìn)行HPLC分析,在11.766 min 處出現(xiàn)了單一對稱的尖峰,表明其為分子質(zhì)量均一的較純組分,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到其分子量約為0.96×103kDa。進(jìn)一步測定其多糖純度為（76.43±0.77）%,蛋白質(zhì)含量為（1.41±0.10）%,糖醛酸含量為（2.29±0.08）%,總酚含量為（0.55±0.24）%。

2.2.2 EPS 的紫外和紅外光譜分析

德氏乳桿菌KY20 的紫外光譜和紅外光譜見圖4。

圖4 德氏乳桿菌KY20 的紫外光譜和紅外光譜Fig.4 Ultraviolet spectrum and infrared spectra of Lactobacillus delbrueckii KY20

如圖4A 所示,純化后的多糖在230～380 nm 波長范圍內(nèi),沒有出現(xiàn)核酸（260 nm）和蛋白質(zhì)（280 nm）的明顯特征吸收峰,說明不存在或存在非常少量的核酸和蛋白質(zhì)。如圖4B 所示,在3 380 cm-1附近具有強(qiáng)且寬的吸收峰,這個(gè)吸收峰是糖類O—H 官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起的,代表該多糖存在分子間和分子內(nèi)氫鍵。在2 927 cm-1處的吸收峰是由C—H 官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起的,在這個(gè)區(qū)域的吸收峰是糖類物質(zhì)的另一個(gè)特征吸收峰。而在1 070 cm-1和1 654 cm-1附近的峰被指定為CO 基團(tuán)；1 240.57 cm-1處—COOH 中O—H變角振動(dòng)吸收峰,代表多糖分子間存在羧基或乙酰基基團(tuán)。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響

德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠體質(zhì)量的影響見表2。

表2 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the weight of obese mice

由表2 可知,各組小鼠初始體質(zhì)量無明顯差異,第7 周之前,除正常組外,其余各組與模型組體質(zhì)量相差不大,7 周后與正常組相比,模型組體質(zhì)量增長較快,給予KY20 和其EPS 組體質(zhì)量增長較為緩慢。第12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),與正常組相比,模型組小鼠體質(zhì)量顯著升高,而KY20 及不同劑量的EPS 對小鼠體質(zhì)量的增加均有抑制作用,其中KY20 及EPS 低劑量組抑制作用最顯著。

2.3.2 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠脂肪質(zhì)量的影響

德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠脂肪質(zhì)量的影響見表3。

表3 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠脂肪質(zhì)量的影響（n=6）Table 3 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the fat weight of obese mice（n=6）

由表3 可知,模型組總脂肪質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量和皮下脂肪質(zhì)量與正常組相比,均具有顯著差異,而肩胛脂肪質(zhì)量無顯著差異。與模型組相比,KY20 能夠顯著減輕附睪脂肪和總脂肪質(zhì)量,但對肩胛脂肪和皮下脂肪質(zhì)量沒有顯著影響。與模型組相比,EPS 低、中劑量組可以顯著減輕附睪脂肪質(zhì)量,EPS 高劑量組對不同組織的脂肪均有一定的減輕作用,但沒有顯著性差異。

2.3.3 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠臟器指數(shù)的影響

德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠臟器指數(shù)的影響見表4。

表4 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對肥胖小鼠臟器指數(shù)的影響（n=6）Table 4 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the organ index of obese mice（n=6）

由表4 可知,高脂飲食對小鼠肝臟、脾臟均具有顯著性影響,而對腎臟和胰腺的影響無顯著性差異。其中對肝臟影響最為顯著,KY20 及不同劑量的EPS 對肥胖小鼠肝臟指數(shù)增大具有顯著的抑制作用,同時(shí)對肥胖小鼠脾臟指數(shù)的增大也具有不同程度的抑制作用,其中KY20 及EPS 低劑量和中劑量組的抑制作用較為顯著。

2.3.4 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠GTT、ITT以及HOMA-IR 的影響

長期的高脂飲食會(huì)引起胰島素介導(dǎo)的相關(guān)作用減弱,比如脂解抑制作用,促使肝臟生成內(nèi)源性葡萄糖,而胰島素不能抑制肝糖原的合成,從而導(dǎo)致肝臟發(fā)生胰島素抵抗,引起了血糖水平的升高[21]。KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠GTT、ITT 以及HOMA-IR 的影響結(jié)果如圖5、圖6、圖7 所示。

圖5 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠糖耐量的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on glucose tolerance in mice fed with high-fat diet

圖6 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠胰島素耐量的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on insulin tolerance in mice fed with high-fat diet

圖7 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠胰島素抵抗的影響Fig.7 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on insulin resistance in mice fed with high-fat diet

由圖5A 可知,注射葡萄糖后各組小鼠的血糖水平均表現(xiàn)為迅速上升,隨后便呈現(xiàn)下降的趨勢,正常組血糖值在2 h 后恢復(fù)到正常水平,而模型組血糖水平下降與其他組相比較為緩慢,2 h 后仍處于較高的水平。由圖5B 可知,模型組、德氏乳桿菌KY20 組及其不同劑量EPS 組的葡萄糖耐量均顯著高于正常組；與模型組相比,德氏乳桿菌KY20 及其不同劑量的EPS均能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠葡萄糖耐量,其中,胞外多糖中劑量組效果顯著。

由圖6A 可知,除KY20 組外,其他組小鼠血糖值水平在注射胰島素30 min 時(shí)降至最低,隨后便呈現(xiàn)回升趨勢,模型組小鼠血糖水平與其他組小鼠相比下降較為遲緩,表現(xiàn)出胰島素抵抗。由圖6B 可知,與模型組相比,KY20 組及EPS 低劑量組均顯著降低。

由圖7 可知,正常組小鼠的胰島素抵抗指數(shù)處于較低水平,模型組小鼠胰島素抵抗指數(shù)最高,而KY20組及其胞外多糖組的小鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著低于模型組。

已有研究證實(shí),嗜酸乳桿菌NS1 顯著減輕了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖并改善胰島素敏感性[22]。Andreasen等[23]以45 名2 型糖尿病患者為研究對象,給予口服補(bǔ)充嗜酸乳桿菌NCFM,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與安慰劑相比,口服NCFM 可以較好地保持胰島素敏感性。本研究中德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖有效改善了肥胖小鼠的胰島素耐受性和葡萄糖耐受性,提高了胰島素敏感性,并改善了胰島素抵抗。

2.3.5 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠肝臟、脂肪的病理學(xué)和血脂指標(biāo)的影響

長期高脂飲食會(huì)引起體內(nèi)代謝紊亂,導(dǎo)致血清中TC、TG、LDL-C 水平的升高和HDL-C 水平降低,引起肝內(nèi)脂肪堆積形成脂肪肝。KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠肝臟、脂肪的病理學(xué)和血脂指標(biāo)的影響如圖8、圖9 和表5 所示。

表5 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量的影響（n=6）Table 5 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on triglyceride（TG），total cholesterol（TC），lowdensity lipoprotein-cholesterol（LDL-C），high-density lipoproteincholesterol（HDL-C）of mice fed with high-fat diet（n=6）mmol/L

圖8 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠肝臟的病理學(xué)影響Fig.8 Pathological effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the liver of mice fed with high-fat diet

圖9 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠脂肪的病理學(xué)影響Fig.9 Pathological effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the fat of mice fed with high-fat diet

由圖8 可知,正常組肝臟組織表現(xiàn)為肝細(xì)胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)整齊,邊界清晰。而模型組小鼠有較明顯的細(xì)胞邊界不清,肝臟結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象,KY20 及其EPS 能夠顯著減輕這些病變,使肝臟組織的形態(tài)趨于正常。

由圖9 可知,正常組小鼠的脂肪細(xì)胞排列較為規(guī)則,呈圓形；而肥胖小鼠脂肪細(xì)胞與其他組小鼠的脂肪細(xì)胞相比明顯偏大,有較明顯的脂肪堆積和脂肪變性,KY20 及其EPS 能夠明顯減小脂肪細(xì)胞體積,使脂肪細(xì)胞形態(tài)和排列趨于正常。

由表5 可知,與正常組相比,模型組的TC、TG、LDL-C 含量顯著升高,而HDL-C 含量顯著降低。與模型組相比,KY20 及其不同劑量的胞外多糖均可以不同程度降低TC、TG、LDL-C 的含量,其中KY20 組能夠較為顯著降低TC、TG 的含量并升高HDL-C 含量,而中劑量組能顯著降低LDL-C 的含量。

研究表明,益生菌可以有效降低血清、血漿中的膽固醇水平,改善整體脂質(zhì)譜。Liu 等[24]研究表明,副干酪乳桿菌24 可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成降低高脂飲食小鼠的體質(zhì)量和脂肪沉積,降低血清膽固醇、肝臟脂肪和甘油三酯含量,改善肝臟脂肪變性。此外,微生物EPSs 由于其減脂降糖、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒活性[25],在食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值。從副干酪乳桿菌M7 分離出的EPS 在體外濃度為0.1%時(shí),將膽固醇水平降低了70.78%[26],從植物乳桿菌RFJ4 中分離得到的EPS 將膽固醇降低了42.24%[27]。植物乳桿菌L-14 的EPS 可以通過TLR2 和AMPK 信號(hào)通路抑制脂肪生成,口服L-14 提取物改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖[28]。本研究證實(shí)德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖均可以有效降低血清中TC、TG、LDL-C 水平,并且升高了HDL-C,也緩解了高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟中脂肪堆積和脂肪細(xì)胞的肥大。

2.3.6 菌株KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠SCFAs的影響

腸道微生物發(fā)酵膳食纖維、多糖產(chǎn)生SCFAs,SCFAs是腸道上皮細(xì)胞的主要能量來源,在維持腸道屏障、調(diào)節(jié)先天免疫、抑制炎癥反應(yīng)和維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用。KY20 及其EPS 對高脂飲食小鼠SCFAs 的影響如圖10 所示。

圖10 德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖對高脂飲食小鼠血脂SCFAs 的影響Fig.10 Effect of Lactobacillus delbrueckii KY20 and its exopolysaccharide on the short chain fatty acids（SCFAs）of mice fed with high-fat diet

由圖10 可知,與正常組相比,模型組的乙酸、丙酸、丁酸的含量顯著降低。與模型組相比,德氏乳桿菌KY20 組及不同劑量的胞外多糖對不同短鏈脂肪酸具有一定的恢復(fù)作用,其中對丁酸的上調(diào)作用最為顯著。Zhao 等[29]發(fā)現(xiàn)SCFAs 中的乙酸和丁酸可以通過上調(diào)肽酪氨酸（peptide tyrosine tyrosine,PYY）和胰高血素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）的水平,抑制中樞神經(jīng),減少食欲,從而達(dá)到減輕體質(zhì)量的效果。本研究通過對肥胖小鼠盲腸內(nèi)容物的檢測發(fā)現(xiàn),德氏乳桿菌KY20 及其胞外多糖均顯著逆轉(zhuǎn)了由高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠丁酸水平下降的情況,從而減輕了肥胖小鼠的體質(zhì)量。

3 結(jié)論

本研究中從德氏乳桿菌KY20 提取的EPS 是分子量為0.96×103kDa 的酸性多糖,EPS 低、中、高劑量對肥胖小鼠各項(xiàng)指標(biāo)均具有一定的改善效果,其中低劑量組和中劑量組在體部分指標(biāo)中具有顯著優(yōu)勢。

KY20 菌株具有良好的酸耐受性和膽鹽耐受能力,且菌株KY20 及其胞外多糖均可以有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖,降低肥胖小鼠的體質(zhì)量,改善血脂代謝紊亂、改善肝臟脂肪變性程度和脂肪細(xì)胞肥大、調(diào)節(jié)葡萄糖耐受和胰島素耐受,因此,本研究對于德氏乳桿菌KY20 及其后生元（胞外多糖）在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)具有積極意義。