ALOX15對BGC823細胞鐵死亡的作用研究

摘要：目的" 探討ALOX15對BGC823細胞鐵死亡的作用。方法" 建立過表達ALOX15或干擾ALOX15表達的BGC823細胞株，采用實時熒光定量PCR法和蛋白免疫印跡（Western Blot）法驗證其轉染效率。CCK-8法檢測過表達ALOX15或干擾ALOX15表達的BGC823細胞的增殖情況，使用試劑盒測定各組細胞中亞鐵離子（Fe2+）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）水平，Western Blot法檢測各組細胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）蛋白水平。結果" 成功構建過表達ALOX15或干擾ALOX15表達的BGC823細胞株。pcDNA3.1-ALOX15組24、48 h細胞增殖率及GSH水平、GPX4表達水平低于pcDNA3.1組、Control組，ROS水平、MDA水平、Fe2+水平、ALOX15 mRNA及蛋白水平高于pcDNA3.1組、Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而轉染si-ALOX15后，si-ALOX15組BGC823細胞24、48 h細胞增殖率及GSH、GPX4表達水平高于si-NC組，ROS水平、MDA水平、Fe2+水平、ALOX15 mRNA及蛋白水平低于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論" 上調ALOX15的蛋白表達水平可促進胃癌細胞鐵死亡。

關鍵詞：鐵死亡；胃癌；ALOX15；BGC823細胞

中圖分類號：R735.2" " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.07.012

文章編號：1006-1959（2024）07-0069-05

Effect of ALOX15 on Ferroptosis in BGC823 Cells

PENG Yao1，DENG Dan-ping2，RONG Ting3，ZOU Jun-jun1

（1.Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410000，Hunan，China;

2.Department of Medical，Chenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chenzhou 423000，Hunan，China;

3.Graduate School，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China）

Abstract：Objective" To investigate the effect of ALOX15 on ferroptosis in BGC823 cells.Methods" BGC823 cell lines with ALOX15 overexpression or ALOX15 interference were established， and the transfection efficiency was verified by quantitative real-time PCRnbsp; and Western Blot. The proliferation of BGC823 cells overexpressing ALOX15 or interfering with ALOX15 expression was detected by CCK-8 method. The levels of ferrous ion （Fe2+）， reactive oxygen species （ROS）， malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） in each group were determined by using kits. The protein level of glutathione peroxidase 4（GPX4）in each group was detected by Western Blot.Results" BGC823 cell lines overexpressing ALOX15 or interfering with ALOX15 expression were successfully constructed. The cell proliferation rate at 24， 48 h， GSH level and GPX4 expression level of pcDNA3.1-ALOX15 group were lower than those of pcDNA3.1 group and Control group， while ROS level， MDA level， Fe2+ level， ALOX15 mRNA and protein level were higher than those of pcDNA3.1 group and Control group， and the differences were statistically significant （Plt;0.05）. After transfection of si-ALOX15， the cell proliferation rate at 24，48 h and the expression of GSH level and GPX4 level in BGC823 cells in si-ALOX15 group were higher than those in si-NC group， and ROS level， MDA level， Fe2+ level， ALOX15 mRNA and protein were lower than those in si-NC group， the differences were statistically significant （Plt;0.05）.Conclusion" Up-regulation of ALOX15 protein expression promotes ferroptosis in gastric cancer cells.

Key words：Ferroptosis;Gastric cancer;ALOX15;BGC823 cells

基金項目：1.長沙市自然科學基金項目（編號：Kq220481）；2.湖南省自然科學基金項目（編號：2022JJ40327）

作者簡介：彭瑤（1986.11-），女，湖南湘潭人，碩士，副主任醫師，主要從事中醫藥防治脾胃病研究工作

通訊作者：鄧丹萍（1985.11-），女，湖南郴州人，碩士，副主任醫師，主要從事中醫藥防治婦科疾病研究工作

胃癌（gastric cancer）是常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來其發病率和死亡率逐漸下降，但到2022年為止，胃癌仍舊是癌癥死亡的五大原因之一[1]。早期胃癌治療后預后較好，甚至達到治愈的效果，然而目前胃癌的早期篩查及治療方法仍然存在不足。因此，尋找胃癌篩查和治療的可靠生物標志物及有效靶點刻不容緩。細胞死亡和細胞存活是維持生命體正常發育和體內平衡的基本過程，細胞死亡失調可導致許多病理現象，包括感染、神經退行性疾病和癌癥等[2-4]。癌癥是一種以細胞死亡失調為特征的異質性疾病，細胞死亡最初主要分為意外性細胞死亡和調節性細胞死亡。其中，鐵死亡是近年來研究最為廣泛的形式之一[4]。鐵死亡被定義為由大量脂質過氧化介導的膜損傷引起的鐵依賴性調節壞死[5]。細胞內脂質活性氧（L-ROS）水平超過谷胱甘肽依賴性過氧化物酶（GPX4）的抗氧化活性，會致使脂質過氧化與代謝功能障礙，從而導致細胞氧化還原穩態的崩潰[6]。鐵死亡的生理功能在多種人類疾病中如缺血性器官損傷、神經退行性疾病和癌癥等發揮了重要作用且已得到證實[7-9]。雖然鐵死亡與人類疾病顯著相關，但其精確的調控機制和生物學功能仍然尚未明確。多不飽和脂肪酸（PUFA）是通過活性氧（ROS）的多個內鍵產生脂質過氧化的重要來源，花生四烯酸脂氧合酶15（arachidonate lipoxygenase 15， ALOX15）是一種非血紅素雙加氧酶，其加速氧化PUFA，而氧化的PUFA與羥基自由基反應，可以產生脂質過氧化和鐵死亡[10]。因此，可以推測ALOX15可誘導胃癌細胞鐵死亡。本研究主要探究ALOX15對胃癌細胞鐵死亡及細胞增殖能力的影響，現報道如下。

1材料與方法

1.1細胞和主要試劑、儀器" 人GC BGC823細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，RPMI-1640培養基（HyClone公司，美國），10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒、GSH試劑盒、Fe2+試劑盒、ROS試劑盒及MDA試劑盒（上海碧云天，中國），jetPRIME轉染試劑（Polyplus轉染，法國），TRIzol試劑（北京全式金，中國），iScriptTMcDNA合成試劑盒、SYBR Green預混液、CFX96 Touch Deep Well實時熒光定量PCR檢測系統和ECL機器（Bio-Rad公司，美國），磷酸酶抑制劑混合物和ECL發光液（Pierce公司，美國），蛋白酶抑制劑Cocktail（Roche公司，瑞士），GPX4、ALOX15和 GAPDH 抗體（CellSignaling Technology公司，美國）。

1.2細胞培養與轉染" 在RPMI-1640培養基中培養BGC823細胞，并補充10% FBS，100 μg/ml鏈霉素和100單位/ml青霉素。將BGC823細胞在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育。當細胞生長密度達到40%～50%時，按照制造商的協議，jetPRIME轉染試劑將細胞用于轉染。ALOX15過表達載體pcDNA3.1-ALOX15和空質粒（pcDNA3.1）、小干擾RNA（si-ALOX15）和si-NC購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.3實時熒光定量PCR" 使用TRIzol試劑從BGC823細胞中提取總RNA。并使用iScriptTM cDNA合成試劑盒（Bio-Rad）將1 μg總RNA用于cDNA合成。使用SYBR Green預混液（Bio-Rad）進行定量實時PCR。在CFX96 Touch Deep Well實時熒光定量PCR檢測系統上獲取樣品并進行分析。用于PCR的引物序列為：ALOX15 forward Primer：5′-GGGCAAGGAGACAGAACTCAA-3′；ALOX15 reverse Primer：5′-CAGCGGTAACAAGGGAACCT-3′；GAPDH forward Primer：5′-TGTGGGCATCAATGGATTG-3′；GAPDH reverse Primer：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。mRNA水平分別歸一化為內部對照（GAPDH）。相對表達水平使用2-ΔΔCt方法計算。

1.4 Western Blot法" 用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細胞，在裂解緩沖液中裂解，補充磷酸酶抑制劑混合物（Pierce）和蛋白酶抑制劑Cocktail（Roche）。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離細胞裂解物并轉膜。用5%脫脂牛奶封閉膜，隨后一抗4 ℃下孵育過夜，在室溫黑暗中二抗孵育1 h，ECL發光液顯影。

1.5細胞增殖情況檢測" 采用細胞計數試劑盒（CCK-8）測定，將BGC823細胞以3000個細胞/孔接種到96孔板中，用100 μl 10%FBS DMEM。根據CCK-8試劑盒的使用說明書，在100 μl完全培養基中稀釋的10 μl CCK-8溶液，在不同時間點（0、24、48 h）替換每組原始培養基。將細胞在37 ℃的黑暗環境中孵育2 h后，在450 nm波長的吸光度A值來檢測細胞增殖情況。結果以增殖率（A測得/A0h control×100%）來表述。

1.6 MDA和GSH水平測定" 收集細胞并在冷的PBS中洗滌，使用1% Triton透化細胞膜，4 ℃下以13 000 g離心10 min，棄去沉淀物，得到上清液。根據相應檢測試劑盒的說明書，采用比色法評估細胞裂解物中MDA和GSH水平。

1.7 ROS水平測定" 收集細胞并在冷的PBS中洗滌，使用1% Triton透化細胞膜，4 ℃下以13 000 g離心10 min，棄去沉淀物，得到上清液。按照1∶1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。加入稀釋好的DCFH-DA，并孵育30 min。再用緩沖液漂洗細胞2次，去除殘留熒光實際，使用分光光度檢測細胞內熒光強度。

1.8鐵含量測定" 細胞內亞鐵（Fe2+）水平是使用鐵測定試劑盒測定的。收集細胞并在冷的PBS中洗滌。將樣品在冰上5倍體積的鐵測定緩沖液中勻漿。收集上清液并在混合前向每個樣品中加入鐵還原劑，并孵育30 min。然后將鐵探針加入到每個樣品中之前混合，并孵育60 min。之后在比色酶標儀上測量分析。

1.9統計學方法" 采用Graphpad prism 9.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。所有實驗均獨立重復3次，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為統計學意義顯著，P＜0.001為統計學意義極顯著。

2結果

2.1 ALOX15對BGC823細胞增殖的影響" CCK-8結果顯示，pcDNA3.1-ALOX15組24、48 h細胞增殖率低于pcDNA3.1組、Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而轉染si-ALOX15后，si-ALOX15組BGC823細胞24、48 h細胞增殖率高于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 ALOX15對BGC823細胞中ROS、MDA、GSH水平的影響" 在BGC823細胞轉染pcDNA3.1-ALOX15后，pcDNA3.1-ALOX15組細胞中ROS及MDA水平高于pcDNA3.1組、Control組，GSH水平低于pcDNA3.1組、Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；si-ALOX15組細胞中ROS及MDA水平低于si-NC組，GSH水平高于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 ALOX15對BGC823細胞中Fe2+水平的影響" pcDNA3.1-ALOX15組細胞中Fe2+水平高于pcDNA3.1組、Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；si-ALOX15組BGC823細胞中Fe2+水平低于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

2.4 ALOX15對BGC823細胞鐵死亡關鍵蛋白GPX4表達水平的影響" pcDNA3.1-ALOX15組BGC823細胞中GPX4表達水平低于pcDNA3.1組、Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；si-ALOX15組BGC823細胞中GPX4表達水平高于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

2.5轉染pcDNA3.1-ALOX15或si-ALOX15的BGC823細胞中ALOX15 mRNA及蛋白水平" pcDNA3.1-ALOX15組BGC823細胞中ALOX15 mRNA及蛋白水平高于pcDNA3.1組、Control組，差異有統計學意義（P＜0.05）；si-ALOX15組BGC823細胞中ALOX15 mRNA及蛋白水平低于si-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

3討論

鐵死亡是非凋亡調節細胞死亡的一種新型形式，其特征在于脂質過氧化產物以細胞-鐵依賴性方式積累[11]。大量研究表明[12-14]，激活鐵死亡相關通路可有效預防腫瘤進展，并增強化療、靶向治療甚至免疫治療的效果。ALOX15是脂氧合酶蛋白家族的成員，作用于各種多不飽和脂肪酸底物，產生各種生物活性脂質介質，被認為是脂質過氧化產生的關鍵介質，可導致鐵死亡[11]。研究表明[10，11，15]，ALOX15介導鐵死亡在小鼠蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷、缺血性心肌損傷、癌癥等疾病中發揮了關鍵的作用。另有研究報道[16]，ALOX15的缺失增加了胃癌細胞的血管生成和致瘤活性。本研究CCK-8實驗結果顯示，pcDNA3.1-ALOX15組24、48 h細胞增殖率低于pcDNA3.1組。而轉染si-ALOX15后，si-ALOX15組BGC823細胞24、48 h細胞增殖率高于si-NC組，表明ALOX15可能在胃癌進展中發揮重要作用，但其對胃癌鐵死亡的作用仍然不清楚。

鐵死亡作為由脂質鐵依賴性脂質過氧化引起的細胞死亡形式，GPX4利用GSH將磷脂氫過氧化物轉化為脂醇來預防鐵死亡，其被認為是預防鐵死亡的主要酶之一[17，18]。因此，抑制GPX4誘導鐵死亡可以觸發癌癥細胞死亡。此外，在癌細胞中要發生鐵死亡需要兩個中心事件：細胞內鐵積累和脂質過氧化。當細胞內積累Fe2+時會引發Fenton反應，導致ROS大量產生，進而引起脂質過氧化[19，20]。本研究中成功建立了轉染過表達ALOX15和干擾ALOX15表達的BGC823細胞株，為了分析ALOX15對胃癌細胞鐵死亡的影響，使用相關試劑盒檢測了鐵死亡相關指標，結果表明pcDNA3.1-ALOX15組細胞中ROS及MDA水平高于pcDNA3.1組，GSH水低于pcDNA3.1組；si-ALOX15組細胞中ROS及MDA水平低于si-NC組，GSH水平高于si-NC組。Western Blot進一步印證了過表達ALOX15抑制鐵死亡關鍵蛋白GPX4的蛋白表達，干擾ALOX15促進GPX4的蛋白表達，說明ALOX15可以調節胃癌細胞鐵死亡。

綜上所述，ALOX15能夠明顯促進胃癌細胞鐵死亡，抑制其增殖，提示ALOX15在胃癌治療中具有潛在的應用價值，可能是篩查和治療胃癌的一個有效靶點。

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收稿日期：2023-04-18；修回日期：2023-05-22

編輯/杜帆