鹽酸多奈哌齊調控lncRNA GAS5對血管性癡呆小鼠認知功能障礙和炎癥反應的影響

陶鈺婷 吳敏佳

摘要?目的：探究鹽酸多奈哌齊（DPH）對血管性癡呆（VD）小鼠認知功能障礙的影響及其作用機制。方法：75只雄性 C57BL/6小鼠按照隨機數字表法分為5組：假手術組（Sham組）、VD模型組、DPH組（VD＋DPH組）、DPH＋長鏈非編碼RNA-生長抑制特異性轉錄本5（lncRNA GAS5）無關片段組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組）以及DPH＋lncRNA GAS5過表達組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組），每組15只。采用小鼠雙側頸總動脈縮窄法構建VD模型。造模成功后2 d，DPH組小鼠給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。Sham組和VD模型組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃處理。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠腦室注射lncRNA GAS5 （每只1 010 pfu）后構建VD模型，2 d后給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠腦室注射lncRNA GAS5 NC后構建VD模型，2 d后給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測腦組織中lncRNA GAS5表達水平；Morris水迷宮實驗檢測各組小鼠學習記憶能力；分光光度法測定腦組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷光甘肽過氧化物酶（GSH-Px）；酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組小鼠腦組織海馬區域病理學改變。結果：與Sham組相比，VD模型組小鼠腦組織lncRNA GAS5水平和MDA含量，血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量均明顯升高（P＜0.01），學習記憶能力、SOD、GSH-Px含量明顯降低（P＜0.01），且海馬區域病理損傷明顯。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠上述指標均被明顯逆轉，海馬區域損傷減輕。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠lncRNA GAS5水平和MDA含量，血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量均升高（P＜0.01），學習記憶能力、SOD、GSH-Px含量明顯降低（P＜0.01），且海馬區域病理損傷加重。結論：DPH能夠改善VD小鼠認知功能障礙和炎癥反應，其機制與抑制lncRNA GAS5表達相關。

關鍵詞?血管性癡呆；認知功能障礙；鹽酸多奈哌齊；炎癥反應；長鏈非編碼RNA-生長抑制特異性轉錄本5

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.014

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指由多種腦血管疾病引起的腦部功能障礙進而產生獲得性神經功能損傷的綜合征［1］。研究證實VD作為老年癡呆的第二大形式，大約占癡呆性疾病的20%～30%［2-3］。伴隨人口老齡化的加劇，VD已經逐漸成為我國老年性癡呆的最主要類型［4］。研究表明導致VD的主要因素為腦血管病變，如小血管病變、大動脈病變等。腦血管病變會進一步引起控制學習、記憶功能的海馬神經元缺血，進而導致神經元損傷和細胞凋亡，并最終引起癡呆［5-6］。鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrochloride，DPH）是治療癡呆的一線藥物，可以通過增強膽堿能神經功能發揮治療作用［7］。既往研究顯示，DPH能夠改善VD小鼠學習和記憶能力障礙，其機制與抑制海馬神經細胞凋亡和炎癥反應相關［8］。但目前有關DPH對VD后認知功能障礙以及炎癥反應的影響尚不

完全清楚。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，可以通過多種方式參與細胞的生長和發育。長鏈非編碼RNA-生長抑制特異性轉錄本5（lncRNA GAS5）是由小鼠胚胎成纖維細胞中分離鑒定出來的［9］。研究表明，lncRNA GAS5是與神經功能損傷密切相關的一類lncRNA。在缺血性腦卒中病人和PC12細胞缺氧復氧后lncRNA GAS5表達顯著升高［10］。另外，研究還發現，降低腦部lncRNA GAS5表達可以降低腦梗死體積，改善神經功能［11］。以上研究提示lncRNA GAS5的高表達可能是促進神經功能損傷的重要調控因子。但是有關lncRNA GAS5對VD小鼠神經功能障礙和炎癥反應的影響尚不完全清楚。因此，本實驗擬通過構建VD小鼠模型，觀察DPH能否通過調控lncRNA GAS5改善VD小鼠神經功能障礙和炎癥反應。

1?材料與方法

1.1?實驗動物

雄性C57BL/6小鼠75只，體質量20～22 g，6～8周齡，實驗動物由南京醫科大學實驗動物學部提供［合格證號：SCXK（蘇）2018-0001］，該實驗通過了我院動物實驗醫學倫理委員會批準，動物實驗遵循3R原則。

1.2?藥品與試劑

DPH粉末（SELLECK公司，純度≥99，批號：120011-70-3）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（碧云天生物技術公司生產，批號：C0105S）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司生產）；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（批號：RAB0311）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA檢測試劑盒（批號：RAB0277）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA檢測試劑盒（批號：RAB0479）購自美國Sigma公司；聚合酶鏈式反應（PCR）檢測試劑盒（江蘇Solarbio公司，批號：SR1110）；引物設計［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.3?儀器

高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司生產，型號：G22-W型）；多功能酶標儀（Thermo賽默飛世爾科技公司生產，型號：SuPerMax 3000FA型）；細胞組織渦旋儀（武漢維塞爾生物科技有限公司生產，型號：M371450型）；TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡（日本/奧林巴斯Olympus）；免疫印跡（Western Blotting）檢測裝置（美國Bio-Rad伯樂公司生產）；GoodLook-1000型成像系統（美國Bio-Rad伯樂公司生產）。

1.4?方法

1.4.1?動物造模與分組

將75只雄性C57BL/6小鼠隨機分為假手術組（Sham組）、VD模型組、DPH組（VD＋DPH組）、DPH＋lncRNA GAS5無關片段組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組）及DPH＋lncRNA GAS5過表達組（VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組），每組15只。采用小鼠雙側頸總動脈縮窄法構建VD模型［12］。造模成功后2 d，DPH組小鼠給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。Sham組和VD模型組小鼠給予等量的生理鹽水灌胃處理。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠給予病毒液腦室注射lncRNA GAS5（每只1 010 pfu）構建VD模型，2 d后給予DPH 1 mg/（kg·d）灌胃8周。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠腦室注射lncRNA GAS5 NC后構建VD模型，2d后給予DPH1 mg/（kg·d）灌胃8周。

1.4.2?實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測腦組織lncRNA GAS5表達水平

按照RNA快速提取試劑盒說明書收集各組小鼠腦組織樣本并提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA溶液OD260 nm/OD280 nm的吸光度值，計算RNA的純度和濃度，按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟將定量的總RNA逆轉錄合成cDNA，采用10 μL逆轉錄反應體系：RNA sample 5.0 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RT Primer 0.5 μL，5×Prime Script Buffer2 2.0 μL，RNase Free dH2O 2.0 μL，37 ℃條件下反應15 min，85 ℃條件下反應5s，反應產物4 ℃條件下保存，接著使用RT-PCR試劑盒進行RT-PCR反應，所有反應均設立3個復孔，每孔采用10 μL反應體系：2×SYBR Green 5.0 μL，Primer Mix 0.8 μL，DNase-free water 3.7 μL，RT product 0.5 μL。相對表達量采用2－△△Ct法計算。lncRNAGAS5正向引物：5′-TCTCACAGGCAGTTCTGTGG-3′，反向引物：5′-ATCCATCCAGTCACCTCTGG-3′；U6正向引物：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。上述引物設計與合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4.3?Morris水迷宮行為學實驗

取6只小鼠進行定位航行實驗：將5組小鼠連續訓練3 d，每天4次。訓練時，將小鼠從面向池壁的4個入水點放入水中，記錄小鼠從水中到明確找到并站立于水下隱蔽平臺的時間，所需時間為小鼠的逃避潛伏期，每組小鼠從池壁的4個入水點分別訓練1次，每次間隔時長30 s?？臻g探索行為實驗：在定位航行實驗結束后，撤去平臺，小鼠從池壁的同一入水點放入水中，記錄小鼠在60 s內穿越原平臺的次數。

1.4.4?MDA、SOD、GSH-Px含量測定

將各組小鼠斷頭處理后快速去除全腦組織，在冰上分離大腦海馬組織，組織碾磨，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度并定量，按照試劑盒說明書操作步驟檢測MDA、SOD、GSH-Px。

1.4.5?HE染色觀察海馬組織病理學形態

乙醚麻醉各組小鼠后，迅速斷頭取腦，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%的多聚甲醛固定各組小鼠海馬組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進行海馬組織染色，顯微鏡下觀察各組小鼠海馬組織形態學變化。

1.4.6?血清炎性因子檢測

各組小鼠麻醉后，取6只小鼠，心臟取血，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取其上清，按照ELISA檢測試劑盒說明書測定IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.5?統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結?果

2.1?各組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達水平比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達明顯升高（P＜0.05）。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達明顯降低（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達明顯升高（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達無明顯差異。詳見圖1。

2.2?各組小鼠學習記憶能力比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿臺指數明顯降低（P＜0.05）。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），穿臺指數明顯增加（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），穿臺指數明顯降低（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠逃避潛伏期和穿臺指數無明顯差異。詳見圖2。2.3?各組小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠海馬組織MDA含量明顯增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性均明顯降低（P＜0.05）。與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠海馬組織MDA含量明顯降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性均明顯升高（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠大腦海馬組織MDA含量明顯增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性均明顯降低（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠海馬組織MDA、SOD、GSH-Px含量無明顯差異。詳見表1。

2.4?各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量比較

與Sham組相比，VD模型組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05）。與VD模型組小鼠相比，VD＋DPH組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量明顯增加（P＜0.05），VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量無明顯差異。詳見表2。

2.5?各組小鼠海馬組織形態學變化

Sham組小鼠海馬CA1區神經元結構完整、清晰，細胞呈極性排列。VD模型組小鼠CA1區海馬神經元數量明顯減少，細胞排列紊亂，細胞大部分皺縮，部分神經元細胞核固縮，染色質出現明顯聚集等。VD＋DPH組小鼠CA1區病理性損傷明顯減輕，神經元結構較為完整，細胞排列相對規則。與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠CA1區病理損傷加重，神經元細胞數量降低，結構紊亂。VD＋DPH＋lncRNA GAS5 NC組小鼠神經元結構與VD＋DPH組小鼠相比無明顯改變。詳見圖3。

3?討?論

VD是一種血管性認知功能障礙和神經退行性疾病，主要表現為神經活動、語言、學習以及記憶能力的障礙。腦部血流長期灌流不足會導致中樞膽堿功能障礙、神經元氧化應激損傷，是學習和記憶能力下降的重要原因［3］。因此，本研究通過雙側頸總動脈縮窄法構建VD小鼠模型。Morris水迷宮實驗結果顯示，與Sham組相比，VD模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，穿臺指數明顯降低，且海馬CA1區出現明顯的病理損傷，表明VD小鼠模型構建成功。VD的危險因素主要包括腦卒中、動脈粥樣硬化、糖尿病以及短暫性腦缺血發作等。既往研究顯示，VD會誘發神經元死亡、炎癥反應過度激活以及認知功能障礙等［13-14］。因此，積極探尋藥物干預治療VD尤為重要。目前臨床上有關VD的治療主要有藥物治療和特殊方式治療等。其中藥物包括神經保護劑、腦組織代謝改善劑等，神經遞質的替代治療是特殊方式治療的關鍵［15］。DPH是治療VD的一線臨床藥品，能夠有效改善病人認知功能障礙、炎癥反應以及神經元凋亡等。但是目前有關DPH對VD的具體作用機制尚不完全清楚。

多項研究發現，lncRNAs與缺血性腦卒中的發生關系密切。在缺血性腦卒中病人腦組織和血液中均發現lncRNAs表達發生顯著改變，提示lncRNAs可能是缺血性腦卒中的潛在標志物［16］。研究顯示，lncRNA GAS5在缺血性腦卒中病人中高表達［17］。另外，體外細胞實驗證實在缺氧復氧處理的原代神經元中lncRNA GAS5表達明顯升高，神經元的存活率降低，抑制lncRNA GAS5表達能夠降低神經元凋亡率［18］。在體動物實驗也證實抑制腦缺血再灌注損傷大鼠lncRNA GAS5表達，能夠降低腦梗死體積，并最終改善神經功能［19］。以上研究表明，lncRNA GAS5在神經功能損傷中發揮重要作用，但是有關lncRNA GAS5對VD神經損傷的影響尚不清楚。本實驗通過qRT-PCR檢測顯示，與Sham組相比，VD模型組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達明顯升高。基于DPH對VD的治療作用以及lncRNA GAS5高表達與神經損傷相關，本研究推測DPH能否通過抑制lncRNA GAS5表達，改善VD神經損傷。為此，本研究通過給予VD小鼠病毒液腦室注射lncRNA GAS5過表達質粒觀察DPH對VD小鼠神經功能障礙的影響，結果顯示，與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠腦組織lncRNA GAS5表達明顯降低，且小鼠學習記憶能力提高，海馬CA1區病理損傷減輕；與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠，上述指標和現象均被明顯逆轉，表明DPH能夠通過抑制lncRNA GAS5表達，從而改善VD誘導的海馬神經損傷。氧化應激性損傷在神經退行性病變中發揮重要作用。腦部血流長期灌流不足會導致MDA含量升高、SOD以及GSH-Px活性降低［20］。另外，血清炎性因子如IL-6、IL-1β、TNF-α等亦是VD損傷的重要檢測指標，在VD小鼠模型中血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達均明顯升高，通過抑制腦部過度氧化應激以及炎癥風暴能夠改善VD神經損傷［21］。本研究結果顯示，與VD模型組相比，VD＋DPH組小鼠氧化應激水平以及炎性因子釋放均明顯降低；與VD＋DPH組相比，VD＋DPH＋lncRNA GAS5 OVE組小鼠氧化應激水平以及炎性因子釋放均明顯升高，表明lncRNA GAS5能夠通過調節氧化應激和炎癥反應，從而影響VD小鼠神經功能障礙。

綜上所述，本研究結果顯示，DPH能夠通過抑制lncRNA GAS5表達，降低氧化應激和炎癥反應，改善VD小鼠認知功能障礙。

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（收稿日期：2022-07-24）

（本文編輯王麗）