金銀花提取物對脂多糖致心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應的影響

初毅 代寧 曹艷杰

摘要目的：探討金銀花提取物對脂多糖（LPS）致心肌細胞氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應的影響及分子機制。方法：將H9c2細胞分為對照（Con）組、LPS組、LPS＋金銀花低劑量組、LPS＋金銀花中劑量組、LPS＋金銀花高劑量組、LPS＋pcDNA組、LPS＋pcDNA含山梨醇和SH3結構域連接蛋白2（SORBS2）組、LPS＋金銀花高劑量＋siNC組、LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組。流式細胞術檢測細胞凋亡；蛋白免疫印記（WesternBlot）法檢測蛋白表達；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）活性、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素1（IL1）、白細胞介素6（IL6）水平。結果：金銀花提取物呈劑量效應降低LPS誘導的H9c2細胞凋亡率、MDA含量、LDH活性，升高SORBS2蛋白表達、SOD活性，降低TNFα、IL1、IL6水平，差異均有統計學意義（P＜0.05）。過表達SORBS2與金銀花提取物作用相同；敲除SORBS2逆轉了金銀花提取物對LPS致心肌細胞氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應的作用。結論：金銀花提取物可能通過上調SORBS2表達抑制LPS致心肌細胞氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應。

關鍵詞金銀花提取物；心肌細胞；氧化應激；細胞凋亡；炎癥反應；脂多糖；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.011

研究表明，心肌細胞凋亡參與許多心血管疾病的發生發展過程；心肌細胞受損之后線粒體氧化應激引起的能量代謝障礙是許多心血管疾病的發病原因，且心肌損傷會引起強烈的炎癥反應，進而加劇心肌細胞凋亡［13］。研究發現，中藥可通過減輕線粒體損傷而抑制心肌細胞凋亡，對心肌細胞損傷具有保護作用［4］。金銀花（LonicerajaponicaThunb）是中國傳統的清熱解毒草藥，具有抗炎、抗菌等作用［5］。研究表明，從金銀花中分離提取的單體化合物JX2B6和JX2B11具有抗過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡的作用［6］。金銀花提取物可抑制肺組織炎性因子的產生，改善脂多糖（LPS）致大鼠急性肺損傷［7］。金銀花提取物可能通過抑制活性氧（ROS）產生，進而抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體通路介導的促炎因子白細胞介素1β（IL1β）和白細胞介素18（IL18）的釋放，緩解肺組織炎癥損傷，從而對重癥急性胰腺炎大鼠的肺損傷具有保護作用［8］。以上研究表明，金銀花提取物具有抗心肌細胞凋亡作用及抗炎作用，然而其對心肌細胞氧化應激和炎癥反應的影響及機制尚不清楚。含山梨醇和SH3結構域連接蛋白2（sorbinandSH3domaincontainingprotein2，SORBS2）為位于4q35.1的一種銜接蛋白，研究報道過表達SORBS2可減少LPS誘導的腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactorα，TNFα）和白細胞介素6（IL6）釋放及細胞凋亡，提高細胞活力［9］。miR213p通過靶基因SORBS2調控LPS誘導的膿毒癥心肌病［10］。因此，本實驗旨在研究金銀花提取物是否能夠通過調控SORBS2表達影響LPS誘導的心肌細胞氧化應激凋亡和炎癥反應。現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

H9c2細胞購自美國ATCC；LPS購自北京索萊寶科技有限公司；金銀花提取物購自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；蛋白提取試劑盒購自美國Epigentek公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）試劑盒、乳酸脫氫酶（lacticdehydrogenase，LDH）試劑盒均購自美國Biovision公司；TNFα、白細胞介素1（IL1）、IL6酶聯免疫吸附試劑盒（ELISA）購自美國Sciencell公司。

1.2細胞處理和分組

將H9c2細胞分為對照（Con）組、LPS組、LPS＋金銀花低劑量組、LPS＋金銀花中劑量組、LPS＋金銀花高劑量組、LPS＋pcDNA組、LPS＋pcDNASORBS2組、LPS＋金銀花高劑量＋siNC組、LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組。LPS組：H9c2細胞培養于DMEM培養基，取對數期細胞，用1μg/mL的LPS處理H9c2細胞；Con組：正常培養細胞；LPS＋金銀花低劑量組：用1μg/mL的LPS和濃度為125μg/mL的金銀花提取物處理細胞；LPS＋金銀花中劑量組：用1μg/mL的LPS和濃度為250μg/mL的金銀花提取物處理細胞；LPS＋金銀花高劑量組：用1μg/mL的LPS和濃度為500μg/mL的金銀花提取物處理細胞；LPS＋pcDNA組：將pcDNA轉染至H9c2細胞后用1μg/mL的LPS處理；LPS＋pcDNASORBS2組：將pcDNASORBS2轉染至H9c2細胞后用1μg/mL的LPS處理；LPS＋金銀花高劑量＋siNC組：將siNC、siSORBS2轉染至H9c2細胞后用1μg/mL的LPS和500μg/mL的金銀花提取物處理；LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組：將siSORBS2轉染至H9c2細胞后用1μg/mL的LPS和500μg/mL的金銀花提取物處理。

1.3流式細胞術檢測細胞凋亡

收集細胞，按試劑盒說明操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4蛋白免疫印記（WesternBlot）法檢測蛋白表達

提取總蛋白，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉膜、封閉，分別加一抗和二抗孵育2h，加增強化學發光試劑（enhancedchemiluminescence，ECL）顯色，暗室顯影、定影；分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.5細胞SOD活性、MDA含量和LDH活性檢測

收集培養48h各組細胞上清液，按試劑盒說明書進行操作。

1.6ELISA檢測TNFα、IL1、IL6水平

收集培養48h各組細胞上清，具體按照試劑盒操作進行檢測。

1.7統計學處理

采用SPSS20.0軟件進行分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1金銀花提取物對LPS處理的H9c2凋亡的影響

與Con組相比，LPS組H9c2細胞凋亡率升高，SORBS2蛋白表達水平下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS＋金銀花低劑量組、中劑量組、高劑量組H9c2細胞凋亡率降低，SORBS2蛋白表達水平升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。詳見圖1～圖4。

2.2金銀花提取物對LPS處理的H9c2中氧化應激的影響

與Con組相比，LPS組H9c2細胞中SOD活性降低，MDA含量、LDH活性升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS＋金銀花低劑量組、中劑量組、高劑量組MDA含量、LDH活性降低，SOD活性升高，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。詳見表1。

2.3金銀花提取物對LPS處理的H9c2中炎性因子的影響

與Con組相比，LPS組TNFα、IL1、IL6水平升高（P＜0.05）；與LPS組相比，LPS＋金銀花低劑量組、中劑量組、高劑量組TNFα、IL1、IL6水平下降，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。詳見表2。

2.4ORBS2對LPS處理的H9c2細胞氧化應激和炎性因子的影響

與LPS組和LPS＋pcDNA組相比，LPS＋pcDNASORBS2組細胞凋亡率、MDA含量、LDH活性降低，SORBS2蛋白表達水平、SOD活性升高，TNFα、IL1、IL6水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3、圖5～圖8。

2.5敲除SORBS2對金銀花作用的H9c2凋亡和氧化應激的影響

與LPS＋金銀花高劑量＋siNC組相比，LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組H9c2細胞凋亡率升高，SORBS2蛋白表達水平降低，SOD活性降低，MDA含量、LDH活性升高（P＜0.05）。詳見表4、圖9～圖12。

2.6敲除SORBS2對金銀花作用于H9c2炎性因子的影響

與LPS＋金銀花高劑量＋siNC組相比，LPS＋金銀花高劑量＋siSORBS2組H9c2細胞中TNFα、IL1、IL6水平升高（P＜0.05）。詳見表5。

3討論

心血管疾病是危害健康的重要疾病，氧化應激、炎癥反應在心血管疾病的發病機制中起重要作用［1112］。研究顯示，中藥具有多靶點效應，通過調節氧化應激、炎癥反應等發揮保護心肌的作用［13］。有研究報道，金銀花提取物可通過降低肺泡灌洗液中促炎細胞因子IL1、IL6和TNFα的釋放和減輕組織臟器的損傷，對LPS誘導的急性呼吸窘迫綜合征大鼠具有顯著的保護作用［14］。金銀花提取物通過抑制小鼠的肝星狀細胞激活，逆轉上皮細胞間充質轉化（EMT）并通過誘導Nrf2激活減少肝臟損傷，從而減輕小鼠肝纖維化［15］。金銀花提取物可通過激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB（NFκB）信號通路來抑制小膠質細胞的炎癥反應［16］。本研究通過建立心肌細胞損傷模型，用不同劑量金銀花提取物處理，發現細胞凋亡率、MDA含量、LDH活性、TNFα、IL1、IL6水平降低，SORBS2蛋白表達水平、SOD活性升高，且呈濃度依賴性，表明金銀花提取物能抑制LPS誘導心肌細胞損傷。

有研究顯示，SORBS2在心肌梗死病人組織中表現出異常降低［17］。LncRNAH19通過調節miR935p/SORBS2軸來抑制敗血癥誘導的心肌損傷的進展［18］。本研究顯示，LPS誘導可降低心肌細胞中SORBS2蛋白表達，過表達SORBS2可降低LPS誘導的心肌細胞凋亡率、氧化應激及炎性因子水平。金銀花提取物可提高SORBS2的表達，而敲除SORBS2逆轉了金銀花提取物對LPS致心肌細胞氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應的作用。

綜上所述，金銀花提取物可通過增加SORBS2減輕LPS致心肌細胞氧化應激、凋亡和炎癥反應。

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（收稿日期：20220921）

（本文編輯郭懷印）

作者單位1.河北省保定市第一醫院（河北保定071000），Email：yoyonaa@126.com；2.河北省保定市清苑區人民醫院

引用信息初毅，代寧，曹艷杰.金銀花提取物對脂多糖致心肌細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（6）：10271032.