基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究夏枯草治療乳腺增生的作用機(jī)制

摘要：目的" 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究夏枯草治療乳腺增生的作用機(jī)制。方法" 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取化合物和疾病相關(guān)靶點(diǎn)，利用String數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用R軟件進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，最后應(yīng)用AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果" 共篩選出13個(gè)活性成分和117個(gè)潛在靶點(diǎn)，潛在靶點(diǎn)涉及應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程以及雌激素信號(hào)通路等與乳腺增生密切相關(guān)的通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示雌激素信號(hào)通路中AKT、MAPK1、CREB、PGR與對(duì)應(yīng)活性成分均能形成穩(wěn)定構(gòu)象。結(jié)論" 夏枯草通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用，發(fā)揮治療乳腺增生的作用。

關(guān)鍵詞：夏枯草；乳腺增生；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；雌激素信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R285" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.10.003

文章編號(hào)：1006-1959（2024）10-0011-06

The Mechanism of Prunella Vulgaris L. in the Treatment of Hyperplasia of Mammary Gland

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

WANG He-song，JIANG Nan，YANG Lan，TAO Guan-cong，LI Ya-yu，ZHANG Hui-ning

（School of Pharmacy，Wannan Medical College，Wuhu 241002，Anhui，China）

Abstract：Objective" To explore the mechanism of Prunella vulgaris L. in the treatment of hyperplasia of mammary gland based on network pharmacology and molecular docking technology.Methods" TCMSP database and GeneCards database were used to obtain compounds and disease-related targets. String database and Cytoscape 3.8.2 software were used to construct protein interaction network. R software was used to analyze GO function and KEGG pathway enrichment. Finally， AutoDock Vina software was used for molecular docking verification.Results" A total of 13 active ingredients and 117 potential targets were screened out. The potential targets involved biological processes such as stress response， signal transduction， transcriptional regulation and cell cycle regulation， as well as estrogen signaling pathway and other pathways closely related to breast hyperplasia. Molecular docking results showed that AKT， MAPK1， CREB， PGR and corresponding active components in the estrogen signaling pathway could form a stable conformation.Conclusion" Prunella vulgaris L. plays a role in the treatment of hyperplasia of mammary gland through multi-component， multi-target and multi-channel synergy.

Key words：Prunella vulgaris L.;Hyperplasia of mammary gland;Network pharmacology;Molecular docking;Estrogen signaling pathway

乳腺增生（hyperplasia of mammary gland）是乳腺導(dǎo)管、乳腺小葉、腺泡上皮及纖維組織的過(guò)度增生[1]。乳腺增生占全部乳腺疾病的75%，發(fā)病率呈逐年升高、低齡化的趨勢(shì)。有研究表明[2]，乳腺增生為乳腺癌的一種癌前病變，可使乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.4～2.5倍。臨床上目前主要使用激素類藥物治療乳腺增生，療效顯著，但藥物的副作用嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。中醫(yī)藥治療具有療效好、毒性低、不易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，在慢性疑難病治療中具有特殊的優(yōu)勢(shì)[4]。中醫(yī)認(rèn)為乳腺增生屬于“乳癖”范疇，因肝郁化火所致[5，6]。夏枯草為唇形科夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫等功效[7]。經(jīng)典古籍《神農(nóng)本草經(jīng)疏》等均有夏枯草治療乳癖、乳巖的記載[8]。現(xiàn)代臨床研究也表明，夏枯草對(duì)治療乳腺增生有明顯療效[9，10]，但夏枯草治療乳腺增生的具體機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等學(xué)科，從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，探索藥物整體的作用機(jī)理，符合中醫(yī)對(duì)疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)[4，11]。因此，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究夏枯草治療乳腺增生的活性成分和作用機(jī)制，并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，旨在為夏枯草的臨床應(yīng)用和藥物研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1資料與方法

1.1篩選夏枯草的活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），將口服利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選的關(guān)鍵參數(shù)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為限定條件，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，篩選夏枯草的活性成分并查詢其作用靶點(diǎn)。檢索String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），限定物種為人，將所獲得靶點(diǎn)的蛋白名稱統(tǒng)一校正為基因名稱。

1.2篩選夏枯草治療乳腺增生的靶基因

檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/），將“hyperplasia of mammary glands”作為關(guān)鍵詞，以相關(guān)分?jǐn)?shù)（relevance score）＞10為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取乳腺增生疾病的靶基因。通過(guò)venny 2.0.2網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html），將活性成分的作用靶點(diǎn)與乳腺增生的靶點(diǎn)取交集，獲得夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)。

1.3“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)”的構(gòu)建

將夏枯草的活性成分與夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（node）表示靶點(diǎn)或化合物，邊（edge）表示藥物、活性成分與乳腺增生之間的相互作用。

1.4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為0.950，隱藏游離點(diǎn)，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，獲得潛在靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，以TSV文件導(dǎo)出。將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，使用“Analyze Network”插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯⒁怨?jié)點(diǎn)大小表示degree繪制靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

使用R4.0.3軟件對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以P＜0.05和Q＜0.05為篩選條件，獲得靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過(guò)程（biological process， BP）、細(xì)胞成分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）以及KEGG信號(hào)通路。

1.6分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用3D軟件轉(zhuǎn)化為三級(jí)結(jié)構(gòu)后以mol2格式保存。通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載雌激素信號(hào)通路中與乳腺增生相關(guān)的蛋白并以PDB格式保存。利用MGLTools1.5.6軟件將活性成分和靶點(diǎn)均轉(zhuǎn)化為PDBQT格式后，利用Vina1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接，選取最佳對(duì)接構(gòu)象作為分子對(duì)接結(jié)果，并通過(guò)PyMol2.5.0軟件進(jìn)行可視化。

2結(jié)果

2.1夏枯草活性成分的篩選

夏枯草的活性成分見(jiàn)表1，其中符合OB≥30%和DL≥0.18限定條件的活性成分共11個(gè)。查閱并整理文獻(xiàn)后，補(bǔ)充2個(gè)。最終獲得黃酮類、甾醇類和三萜類化合物共13個(gè)。

2.2夏枯草治療乳腺增生的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢獲得98個(gè)活性成分作用靶點(diǎn)，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得862個(gè)乳腺增生疾病靶點(diǎn)。通過(guò)venny 2.0.2網(wǎng)站將活性成分作用靶點(diǎn)與乳腺增生疾病靶點(diǎn)取交集，得到夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)117個(gè)，見(jiàn)圖1。

2.3“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建“夏枯草-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”見(jiàn)圖2，圖中矩形的大小表示靶點(diǎn)的度值（Degree）。由圖可知PTGS2、PPARG、PIK3CG、HSP90AA1、CD40LG、CASP3、PGR等是夏枯草活性成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將117個(gè)夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息。該網(wǎng)絡(luò)包括117個(gè)節(jié)點(diǎn)，391條邊，平均度值為6.68。下載PPI網(wǎng)絡(luò)信息，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，根據(jù)靶點(diǎn)度值篩選核心靶點(diǎn)，并構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖見(jiàn)圖3。由圖可知，AKT、JUN、STAT3、TP53、HSP90AA1為核心靶點(diǎn)，其度值分別為32、32、30、26、24。

2.5 GO功能富集

通過(guò)R-clusterprofile包對(duì)117個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共獲得GO條目2641條，其中BP、CC、MF分別有2445、50、145條。按照Q值進(jìn)行排序，分別篩選前10條GO條目繪制氣泡圖（圖4）。可見(jiàn)，BP條目主要涉及應(yīng)激反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激、化學(xué)應(yīng)激等。CC條目主要涉及膜結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期蛋白等。MF條目主要涉及受體配體活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。此外，分析發(fā)現(xiàn)乳腺相關(guān)GO條目涉及的基因包括PGR、BAX、AR、AKT、NCOA1、MAPK1、H1F1A、CAV1、FASN、CREB1。

2.6 KEGG通路富集

KEGG富集分析得到166條通路，按照Q值從小到大排序，篩選前30條通路繪制柱狀圖見(jiàn)圖5。可見(jiàn)，涉及的通路包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、傳染性疾病、糖尿病并發(fā)癥、癌癥、免疫、激素相關(guān)的信號(hào)通路等。其中，與乳腺增生密切相關(guān)的通路包括雌激素信號(hào)通路、泌乳素信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、卵巢類固醇激素合成、GnRH釋放等通路。雌激素信號(hào)通路見(jiàn)圖6，灰色代表夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)。

2.7分子對(duì)接預(yù)測(cè)成分和靶點(diǎn)的結(jié)合能力

依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”，將雌激素信號(hào)通路中與乳腺增生相關(guān)的靶點(diǎn)AKT、ERK、CREB、PGR與對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接（表2），結(jié)果顯示除了AKT與對(duì)應(yīng)的活性成分有較好的結(jié)合能力外，其他靶點(diǎn)均與對(duì)應(yīng)活性成分有強(qiáng)烈的結(jié)合能力。

3討論

中醫(yī)認(rèn)為乳腺增生屬于“乳癖”范疇，因肝郁化火所致[5，6]。夏枯草為唇形科夏枯草的干燥果穗，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫的功效[7]，對(duì)治療乳腺增生有明顯療效[9，10]，但夏枯草治療乳腺增生的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，獲得夏枯草治療乳腺增生的活性成分包括β-谷甾醇、山柰酚、α菠甾醇、豆甾烯醇、飛燕草色素、木犀草素、黃質(zhì)-I、豆甾醇葡萄糖苷、7-豆甾烯醇、桑色素、槲皮素、齊墩果酸、熊果酸。有研究表明，槲皮素在體外具有抗增殖活性，可抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點(diǎn)，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12，13]。熊果酸能顯著抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。以β-谷甾醇為代表的植物甾醇具有雌激素樣作用，可與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮雌激素或抗雌激素作用[15]。因此，夏枯草可能以槲皮素、β-谷甾醇和熊果酸等多種活性成分協(xié)同發(fā)揮治療乳腺增生的作用。

研究表明[2]，“下丘腦-垂體-性腺軸”失衡，體內(nèi)雌二醇、孕酮及垂體催乳素等內(nèi)分泌激素紊亂是導(dǎo)致乳腺增生發(fā)生的原因。本研究通過(guò)GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)夏枯草治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)涉及應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程以及雌激素信號(hào)通路、泌乳素信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、卵巢類固醇激素合成、GnRH釋放等與乳腺增生密切相關(guān)的通路，與乳腺增生的發(fā)病機(jī)制相吻合。另有研究表明[16]，夏枯草對(duì)下丘腦－垂體激素的作用不明顯，但對(duì)雌激素、孕酮的作用比較明顯。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也多認(rèn)為雌激素分泌相對(duì)過(guò)多，孕激素分泌相對(duì)過(guò)少是導(dǎo)致乳腺增生的常見(jiàn)原因[2]。因此推測(cè)，雌激素信號(hào)通路可能是夏枯草治療乳腺增生的關(guān)鍵信號(hào)通路。

雌激素是通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)一系列信號(hào)傳導(dǎo)[17]。研究表明[18，19]，雌激素與其膜受體結(jié)合可以激活PI3K/Akt或MAPK等多條信號(hào)通路，從而參與細(xì)胞增殖和凋亡等生物過(guò)程，也可以通過(guò)調(diào)控CREB等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。通常認(rèn)為配體與受體結(jié)合能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。結(jié)合能小于-4.25 kcal/mol，表示配體與受體有一定的結(jié)合活性；結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol，表示配體與受體有較好的結(jié)合活性；結(jié)合能小于-7.0 kcal/mol，表示配體與受體有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[20]。本研究將雌激素信號(hào)通路上的蛋白與對(duì)應(yīng)成分進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)雌激素信號(hào)通路中AKT、MAPK1、PGR、CREB均可與對(duì)應(yīng)活性成分較好的結(jié)合，因此推測(cè)夏枯草可能通過(guò)調(diào)控雌激素信號(hào)通路中PI3K/Akt通路或MAPK信號(hào)通路或直接作用于轉(zhuǎn)錄因子，多途徑協(xié)調(diào)作用發(fā)揮治療乳腺增生的作用，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，夏枯草可能通過(guò)槲皮素、β-谷甾醇、熊果酸等多種活性成分，通過(guò)調(diào)控雌激素信號(hào)通路中PI3K/Akt或MAPK通路或直接作用于轉(zhuǎn)錄因子，多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用發(fā)揮治療乳腺增生的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]張金愛(ài)，張國(guó)營(yíng).中西醫(yī)結(jié)合治療乳腺增生病1080例[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（30）：4722-4723.

[2]尹佳，馬金柱.蒙藥乳腺-Ⅰ號(hào)（M-Ⅰ）治療乳腺增生的機(jī)制研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2021，37（17）：2373-2376.

[3]Yang JM，Wu JH，Shen XY，et al.Efficacy of moxibustion by stimulating acupoints of Danzhong （CV17） and Ganshu （BL 18） on hyperplasia of mammary gland in rats[J].J Tradit Chin Med，2018，38（1）：76-82.

[4]趙宏，孔令洲，張宇，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究巴亞格七味散對(duì)酒精性肝病的作用機(jī)制[J].中藥新藥與臨床藥理，2021，32（10）：1480-1489.

[5]張志強(qiáng).夏枯草片加逍遙丸治療乳腺增生癥臨床分析[J].中醫(yī)臨床研究，2017，9（32）：104-105.

[6]曾飛劍，李廷冠.小金丸夏枯草膠囊聯(lián)用治乳腺囊性增生癥（肝郁痰凝型）36例[J].江西中醫(yī)藥，2009，40（11）：43.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：292.

[8]繆希雍.神農(nóng)本草經(jīng)疏[M].點(diǎn)校本.北京：中醫(yī)古籍出版社，2002：431.

[9]唐甜，閔美林.夏枯草口服液應(yīng)用于乳腺纖維腺瘤手術(shù)后的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，40（4）：472-476.

[10]劉義芬，陳章生.單味夏枯草治療乳腺增生病32例臨床觀察[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1999，10（10）：772.

[11]杜康，王唯丁，韓彬，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究“虎杖-女貞子”配伍治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[J].中國(guó)中藥雜志，2022，47（6）：1677-1686.

[12]Chen X，Xu PL，Zhang HJ，et al.EGFR and ERK activation resists flavonoid quercetin induced anticancer activities in human cervical cancer cells in vitro[J].Oncol Lett，2021，22（5）：754.

[13]Deng XH，Song HY，Zhou YF，et al.Effects of quercetin on the proliferation of breast cancer cells and expression of survivin in vitro[J].Exp Ther Med，2013，6（5）：1155-1158.

[14]Wang SQ，Chang X，Zhang JP，et al.Ursolic Acid Inhibits Breast Cancer Metastasis by Suppressing Glycolytic Metabolism via Activating SP1/Caveolin-1 Signaling[J].Front Oncol，2021，11：745584.

[15]陶仕英，牛建昭，趙丕文，等.β-谷甾醇對(duì)T47D細(xì)胞雌激素受體表達(dá)及其下游基因PS2的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2015，21（2）：165-167，174.

[16]郭娜.夏枯草顆粒對(duì)氣滯血瘀證乳腺增生模型大鼠下丘腦-垂體-性腺相關(guān)激素分泌和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響[J].中醫(yī)臨床研究，2017，9（36）：97-100.

[17]Li XD，Huang J，F(xiàn)luharty BR，et al.What are comparative studies telling us about the mechanism of ER action in the ERE-dependent E2 signaling pathway？[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2008，109：266-272.

[18]Lee YR，Park J，Yu HN，et al.Up-regulation of PI3K/Akt signaling by 17β-estradiol through activation of estrogen receptor-α， but not estrogen receptor-β， and stimulates cell growth in breast cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，336（4）：1221-1226.

[19]Zhao Y，Xu Y，Zheng HX，et al.QingYan formula extracts protect against postmenopausal osteoporosis in ovariectomized rat model via active ER-dependent MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways[J].J Ethnopharmacol，2020，268：113644.

[20]梁研，孫若嵐，劉夫艷，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析黃芪-莪術(shù)-蚤休角藥配伍抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制[J].中國(guó)中藥雜志，2022，47（3）：776-785.

收稿日期：2023-06-19；修回日期：2023-06-29

編輯/肖婷婷