小白菊內酯通過抑制Piezo1 表達對機械牽張應力作用下軟骨細胞凋亡的影響及其機制

［摘 要］ 目的：探討小白菊內酯 （PTL） 通過調控機械敏感性離子通道蛋白1（Piezo1） 表達對機械牽張應力作用下軟骨細胞凋亡的影響，并闡明其相關作用機制。方法：按照拉伸性變量將軟骨細胞分為0%、5%、10%、15% 和20% 拉伸組。另取軟骨細胞，分為對照組、20% 拉伸組、20% 拉伸+5 μmol·L-1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組。使用Piezo1短發夾RNA （shRNA） 干擾慢病毒（sh-Piezo1） 或shRNA-NC 慢病毒感染軟骨細胞，將軟骨細胞分為sh-Piezo1 組和sh-NC 組，另設置空白對照組。另將軟骨細胞分為20% 拉伸組、20% 拉伸+PTL 組、20% 拉伸+sh-Piezo1 組和20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組。Hoechst 33258 熒光染色觀察各組細胞核形態表現，流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，分光光度法檢測各組細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3 活性， CCK-8 法檢測各組細胞增殖率， Fluo-4/AM 熒光探針法檢測各組細胞中鈣離子（Ca2+） 水平，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測各組細胞中Piezo1 mRNA 表達水平，Westernblotting法檢測各組細胞中Piezo1蛋白表達水平。結果：Hoechst 33258熒光染色觀察，隨著拉伸量逐漸增加，0%、5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞細胞核呈碎塊狀致密濃染的軟骨細胞數量逐漸增加。流式細胞術檢測，與0% 拉伸組比較，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）； 與對照組比較， 20% 拉伸組軟骨細胞中細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）； 與20% 拉伸組比較， 20% 拉伸+5 μmol·L-1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組軟骨細胞細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+ sh-Piezo1 組軟骨細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）。分光光度法檢測，與0%拉伸組表示，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯升高（Plt;0. 01）；與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20%拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05）。CCK-8 法檢測，與0 μmol·L－1 PTL 組比較， 40. 00、80. 00 和160. 00 μmol·L-1 PTL 組軟骨細胞增殖率均明顯降低（Plt;0. 05）， 提示20. 00 μmol·L-1 PTL 為最高無毒性作用濃度。Fluo-4/AM 熒光探針法檢測，與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Ca2+水平明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Ca2+水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Ca2+水平均明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測，與空白對照組和sh-NC 組比較，sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 mRNA 表達水平明顯降低（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測，與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與空白對照組和sh-NC 組比較，sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平明顯降低 （Plt;0. 05）。結論：PTL可抑制高強度周期性機械牽張應力誘導的軟骨細胞凋亡，其作用機制可能與抑制Piezo1 介導Ca2+內流引起的細胞凋亡有關。

［關鍵詞］ 小白菊內酯； 機械敏感離子通道蛋白1； 機械牽張應力； 軟骨細胞； 細胞凋亡

［中圖分類號］ R681. 3 ［文獻標志碼］ A

骨關節炎是一種非炎癥性的退行性關節病，患者行動過程中會引發關節疼痛和僵硬，其生活質量受到嚴重影響［1-2］。骨關節炎發病機制復雜，機械負荷是其發展過程中的重要因素之一。適度機械負荷能促進軟骨細胞生長發育，增強細胞合成代謝。但過度機械負荷會導致軟骨細胞凋亡，進而引發軟骨細胞丟失和骨關節炎發生［3］。因此，抑制過度機械負荷后軟骨細胞的凋亡是防治骨關節炎的關鍵。機械敏感性離子通道蛋白1 （piezo typemechanosensitive ion channel component 1， Piezo1）是一種機械敏感性離子通道蛋白，可感受細胞膜機械力的變化， 包括壓縮、拉伸、重力和流體剪切等，通過增強鈣離子（calcium ion，Ca2+） 內流改變膜電位進而將胞外機械信號轉化為胞內生物信號，參與調節發育、腫瘤發生和骨重塑等多種細胞生命進程［4-6］。然而，過度的機械應力刺激可導致Piezo1 高表達， 造成Ca2+ 大量內流， 引起細胞凋亡。陳墨龍等［7］ 發現： 過度機械牽拉應力通過激活Piezo1 和下游需鈣蛋白酶2 （calpain 2，CAPN2） /B 細胞淋巴瘤2 相關X 蛋白（B-celllymphoma-2-associated X protein， BAX） /含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specificproteinase， Caspase）-3 通路誘導肌腱細胞凋亡。WANG 等［8］ 發現：Piezo1 在小鼠骨關節炎模型和機械牽張應力作用下的人軟骨細胞模型中高表達，抑制其表達可降低Ca2+水平并上調谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4， GPX4） 表達，從而減少小鼠骨關節炎程度和人軟骨細胞凋亡水平。Piezo1 可能是治療機械性骨關節炎的潛在靶點。小白菊內酯（parthenolide，PTL） 是一種倍半萜烯內酯類天然產物，來源于艾菊和觀光木等藥用植物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗動脈粥樣硬化等多種重要的藥理活性，臨床上常用于治療偏頭痛、發熱和類風濕性關節炎等［9］。研究［10-11］ 發現：PTL 可通過抗炎途徑發揮改善膝骨關節炎模型動物關節損傷的作用。然而， PTL 與Piezo1 的關系及其對高強度的機械牽張應力作用下軟骨細胞凋亡的影響尚未完全闡明。本研究探討PTL 對機械牽張應力作用下軟骨細胞中Piezo1 的調控作用及干擾Piezo1 對細胞凋亡的影響， 并闡明其相關作用機制，為骨關節炎的治療提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器 永生化人關節軟骨細胞及其專用培養液購自上海康朗生物科技有限公司。4% 多聚甲醛固定液、Hoechst 33258 染色液、Caspase-3 活性檢測試劑盒和Ca2+ 熒光探針（Fluo-4/AM） 購自上海碧云天生物技術有限公司，PTL 購自美國MCE 公司， CCK-8 檢測試劑盒和Annexin Ⅴ -FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海） 股份有限公司，Piezo1 抗體購自美國ThermoFisher Scientific 公司，GAPDH 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公，Piezo1 引物、Piezo1 短發夾RNA （short hairpin RNA， shRNA）干擾慢病毒（sh-Piezo1，滴度：3. 12×108 TU·mL－1）及其陰性對照慢病毒（shRNA-NC，滴度：1. 36×108 TU·mL-1） 由上海和元生物技術有限公司提供。張力系統（型號： Flexcell-5000） 購自美國Flexcell 公司， CO2 培養箱（型號： 311） 和化學發光成像系統（ 型號： CL750） 購自美國ThermoFisher Scientific 公司， 倒置熒光顯微鏡（型號：CKX41） 購自日本Olympus 公司，流式細胞儀（型號：FACSCtoⅡ） 購自美國BD 公司，多功能酶標儀（ 型號： HH34000000） 購自美國Perkinelmer 公司。

1. 2 細胞培養 永生化人關節軟骨細胞采用專用培養液置于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，待細胞密度生長至90% 時， 棄去培養基， 加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 清洗1 次，加入1 mL 胰蛋白酶室溫消化2 min，待大部分細胞變圓脫落后，加入2 mL 軟骨細胞專用培養液終止消化，收集細胞離心后分瓶培養并用于后續實驗。

1. 3 慢病毒感染 收集對數生長期軟骨細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種至6 孔細胞培養板，置于培養箱中過夜。以病毒感染復數200 加入64. 1 mLsh-Piezo1 或147. 1 μL shRNA-NC 慢病毒， 將細胞分為sh-Piezo1 組和sh-NC 組，另設置空白對照組。同時，加入5 mg·L-1 Polybrene 促進病毒感染，8 h 后更換新鮮培養液繼續培養，72 h 后收集細胞進行后續檢測。

1. 4 周期性機械牽張應力刺激細胞 取對數生長期人軟骨細胞，按照每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，待細胞生長至約80% 融合度時，采用Flexcell-5000 張力系統對軟骨細胞進行周期性機械拉伸［4］，以3 s 受力和3 s 放松為1 個周期，進行機械拉伸，頻率設置為0. 5 Hz，拉伸性變量為5%～20%，拉伸36 h。

1. 5 細胞分組和處理 按照拉伸性變量將軟骨細胞分為0%、5%、10%、15% 和20% 拉伸組。另取軟骨細胞，分為對照組、20% 拉伸組、20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組。其中對照組不作任何處理；20% 拉伸組軟骨細胞給予拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應力刺激36 h； 20% 拉伸+5 μmol·L-1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L-1PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L-1 PTL 組軟骨細胞在20% 拉伸的基礎上分別給予5、10 及20 μmol·L-1PTL 處理。

另取軟骨細胞，將其分為20% 拉伸組、20% 拉伸+PTL 組、20% 拉伸+sh-Piezo1組和20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組。其中20% 拉伸+PTL 組軟骨細胞進行拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應力刺激36 h，同時給予20 μmol·L-1 PTL；20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞感染sh-Piezo1 慢病毒后再進行拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應力刺激36 h 處理； 20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞感染sh-Piezo1 慢病毒后再進行拉伸性變量為20% 的周期性機械牽張應力刺激和20 μmol·L-1PTL 干預36 h。

1. 6 Hoechst 33258熒光染色觀察各組細胞核形態表現 取對數生長期軟骨細胞，以每孔3×104個細胞的密度接種至6 孔細胞培養板，置于培養箱中過夜，給予拉伸性變量為0%～20% 的周期性機械牽張應力刺激36 h。取出培養板，經4% 多聚甲醛固定液室溫固定10 min ， PBS 緩沖液清洗3 次，每孔加入500 μL Hoechst 33258 染色液，室溫避光孵育5 min， PBS 緩沖液清洗3 次， 熒光顯微鏡觀察細胞核形態表現。

1. 7 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率 收集各組細胞，加入400 μL Annexin Ⅴ-FITC 結合液重懸細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 染色液，輕輕吹打混勻，再加入10 μL PI 染色液，輕輕吹打混勻，室溫（20 ℃～25 ℃） 避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1. 8 分光光度法檢測各組細胞中 Caspase-3活性 收集各組細胞，PBS 緩沖液清洗1 次，加入100 μL裂解液于冰上裂解15 min， 4 ℃ 、20 000 g 離心10 min， 取上清， 參照Caspase-3 活性檢測試劑盒檢測說明書操作， 同時設置標準品組。采用酶標儀檢測波長405 nm 處吸光度（A） 值，根據標準品A 值和標準品濃度繪制標準曲線，計算各組細胞中Caspase-3 活性。Caspase-3 活性= 實驗孔A 值/對照孔A 值。

1. 9 CCK-8法檢測各組細胞增殖率 收集對數生長期軟骨細胞，以每孔3×103個細胞的密度接種至96 孔細胞培養板中，置于培養箱中過夜。給予0、1. 25、2. 50、5. 00、10. 00、20. 00、40. 00、80. 00 和160. 00 μmol·L-1 PTL 處理36 h， 并設置空白孔，提前4 h 取出培養板，每孔加入10 μL CCK-8 工作液， 37 ℃ 孵育4 h， 采用多功能酶標儀檢測波長450 nm 處A 值。細胞增殖率= ［ （實驗孔A值－ 空白孔A 值） / （對照孔A 值－ 空白孔A值）］ ×100%。

1. 10 Fluo-4/AM 熒 光 探 針 法 檢 測 各 組 細 胞 中Ca2+水平 收集各組細胞，PBS緩沖液清洗 3次，加入500 μL 1 μmol·L-1 Fluo-4/AM 工作液， 37 ℃避光孵育45 min，PBS 緩沖液清洗3 次，流式細胞儀檢測細胞中Fluo-4 熒光強度，以Fluo-4 熒光強度代表細胞中Ca2+水平。

1. 11 實時熒光定量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組細胞中Piezo1 mRNA 表達水平 收集各組細胞，加入TRIzol 裂解液，于冰上提取總RNA。多功能酶標儀檢測RNA 濃度，逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA 并擴增。以β-actin 為內參，采用2－△△Ct 法計算Piezo1 mRNA 表達水平。引物序列： Piezo1 F5'-ATCGCCATCATCTGGTTCCC-3'， R 5'-TGGTGAACAGCGGCTCATAG-3'； β -actin F 5'-GCCGCCAGCTCACCAT-3'， R 5'-TCGTCGCCCACATAGGAATC-3'。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40 次循環。

1. 12 Western blotting 法檢測各組細胞中 Piezo1蛋白表達水平 收集各組細胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min 提取總蛋白，4 ℃、12 000 r·min－1離心5 min 收集上清， 金屬浴煮沸10 min。采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度， 每組細胞取30 μg 蛋白上樣、電泳和轉膜處理后， 50 g·L-1 脫脂奶粉室溫孵育1 h，加入Piezo1 抗體（1∶1 000）和β-actin （1∶10 000） 抗體4 ℃孵育過夜，TBST 溶液清洗3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，滴加顯影液，凝膠成像儀顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 13 統計學分析 使用SPSS 26. 0統計軟件進行統計學分析。各組細胞凋亡率、細胞增殖率、細胞中Ca2+水平、Caspase-3 活性和Piezo1 mRNA 及蛋白表達水平均符合正態分布，以x±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組軟骨細胞核形態表現 凋亡細胞的細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染， 熒光亮度增強。隨著拉伸量逐漸增加，0%、5%、10%、15%和20% 拉伸組軟骨細胞的細胞核呈碎塊狀致密濃染的軟骨細胞數量逐漸增加。見圖1。

2. 2 各組軟骨細胞凋亡率 與 0% 拉伸組比較，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞凋亡率均明顯升高（Plt;0. 01）。與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中細胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）； 與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－ 1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）。與 20% 拉伸組（36. 36%±2. 61%）比較，20% 拉伸 + PTL 組（18. 80%±1. 41%） 和20% 拉伸+sh-Piezo1 組（11. 34%± 2. 49%） 軟骨細胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）；與20% 拉伸+sh-Piezo1 組比較， 20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組（11. 86%±2. 17%） 軟骨細胞凋亡率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖2～6。

2. 3 各組軟骨細胞中Caspase-3活性 與0%拉伸組比較，5%、10%、15% 和20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯升高（Plt;0. 01）。與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Caspase-3 活性明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μmol·L－1PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05）。與20%拉伸組比較， 20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Caspase-3 活性均明顯降低（Plt;0. 05），20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。與20% 拉伸+sh-Piezo1 組比較， 20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖7～9。

2. 4 各組軟骨細胞增殖率 與0 μmol·L－1 PTL 組比較，1. 25、2. 50、5. 00、10. 00 和20. 00 μmol·L－1PTL 組軟骨細胞增殖率差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）， 40. 00、80. 00 和160. 00 μmol·L－1 PTL 組軟骨細胞增殖率均明顯降低（Plt;0. 05），提示20. 00 μmol·L－ 1 PTL 為最高無毒性作用濃度。見圖10。

2. 5 各組軟骨細胞中 Ca2+水平 與對照組比較，20% 拉伸組軟骨細胞中Ca2+水平升高（Plt;0. 05）；與20%拉伸組比較，20%拉伸+5 μmol·L－1 PTL 組、20% 拉伸+10 μ mol·L － 1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－ 1 PTL 組軟骨細胞中Ca2+ 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與20% 拉伸組比較，20% 拉伸+PTL 組和20% 拉伸+sh-Piezo1 組軟骨細胞中Ca2+水平均明顯降低（ Plt;0. 05），20%拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Caspase-3 活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）； 與20% 拉伸+sh-Piezo1 組比較，20% 拉伸+sh-Piezo1+PTL 組軟骨細胞中Ca2+ 水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖11～14。

2. 6 各組細胞中Piezo1 mRNA表達水平 與空白對照組（0. 99±0. 03） 和sh-NC 組（0. 95±0. 05）比較， sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 mRNA 表達水平（0. 20±0. 08） 明顯降低（Plt;0. 05）。

2. 7 各組軟骨細胞中 Piezo1蛋白表達水平 與對照組比較， 20% 拉伸組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）；與20% 拉伸組比較，20% 拉 伸 + 5 μmol·L－ 1 PTL 組、20% 拉 伸+10 μmol·L－ 1 PTL 組和20% 拉伸+20 μmol·L－ 1PTL 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與空白對照組（0. 43±0. 05） 和sh-NC 組（0. 42±0. 06） 比較， sh-Piezo1 組軟骨細胞中Piezo1 蛋白表達水平（0. 07±0. 03） 明顯降低（Plt;0. 05）， 提示軟骨細胞中Piezo1 基因表達被成功干擾。見圖15 和16。

3 討 論

研究［12］ 顯示：機械負荷過高誘導的軟骨細胞凋亡是誘發骨關節炎的因素之一，長期從事體力勞動人群、肥胖人群及運動員關節長期受到過度負荷， 更易導致關節炎。CHANG 等［13］ 發現： 過度的機械負荷會通過DAN 結構域BMP 拮抗劑家族成員1 （DAN domain BMP antagonist family member 1，gremlin-1） /核因子κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB） 途徑促進小鼠骨關節炎發展。ZHAO 等［14］發現：機械超負荷誘導的微小RNA （microRNAs，miR）-325-3p 表達水平降低可促進軟骨細胞衰老，加劇小關節退變。伍偉挺等［15］ 發現：高負荷周期性機械應力可能通過激活內質網應激通路加速軟骨細胞凋亡，促進軟骨細胞炎癥反應。本研究結果顯示：在體外培養的軟骨細胞中，周期性機械牽張應力可明顯誘導軟骨細胞凋亡，并上調Piezo1 表達。PTL 和干擾Piezo1 基因表達均可抑制周期性機械牽張應力誘導的軟骨細胞凋亡， 同時抑制Ca2+內流， 提示PTL 在周期性機械牽張應力介導的軟骨細胞凋亡的作用和機制，可能為骨關節炎臨床治療提供新方向。

Piezo1 是機械敏感離子通道蛋白，其參與腫瘤細胞、肌腱細胞和軟骨細胞等多種細胞機械負荷誘導的凋亡進程［7，16-17］。Piezo1 在軟骨細胞中穩定表達，不僅可以通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedprotein kinase，MAPK） /細胞外調節蛋白激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2） 的經典MAPK 信號通路參與細胞凋亡過程，還可介導機械刺激下Ca2+內流，維持細胞內游離Ca2+和結合鈣動態平衡［18］。過度機械負荷可激活Piezo1 介導細胞內Ca2+超載，導致線粒體呼吸功能障礙及內質網應激，從而啟動Caspase 級聯反應，進而誘導細胞凋亡［19-20］。因此，下調Piezo1 表達可能抑制胞內Ca2+超載增強軟骨細胞機械負載的抵抗閾值，促進細胞活性，從而改善骨關節炎。本研究結果顯示：干擾Piezo1 基因表達可抑制周期性機械牽張應力誘導的軟骨細胞凋亡，并降低細胞內Ca2+水平， 提示Poezo1 激活介導Ca2+超載是周期性機械牽張應力誘導軟骨細胞凋亡的關鍵因素。

PTL 來源于藥草短舌匹菊的倍半萜內酯， 具有抗炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用。朱芳曉等［21］發現： PTL 可減輕兔骨關節炎癥狀， 可能是通過抑制血清和關節腔腫瘤壞死因子α （tumor necrosisfactor alpha， TNF- α） 和 白 細 胞 介 素 1β（interleukin-1β， IL-1β） 等炎癥因子分泌實現的。LIU 等［10］ 發現： Piezo1 可抑制促炎細胞因子的產生，并對膠原誘導的大鼠關節炎的進展表現出保護作用。然而，高強度的機械牽張應力被認為是導致骨關節炎的重要外界致病因素， 但PTL 對高強度的機械牽張應力作用下軟骨細胞凋亡的影響尚未完全闡明。本研究結果顯示： PTL 可以有效抑制周期性機械牽張應力誘導的軟骨細胞凋亡，并下調細胞中Piezo1 表達，同時降低軟骨細胞中Ca2+水平和Caspase-3 活性， 而在Piezo1 基因沉默的軟骨細胞中加入PTL 干預后， 并未進一步抑制周期性機械牽張應力誘導的軟骨細胞凋亡，提示PTL 通過調控Piezo1 表達，發揮抑制周期性機械牽張應力誘導軟骨細胞凋亡的作用。

綜上所述， 周期性機械牽張應力可通過調控Piezo1 介導Ca2+超載促進軟骨細胞凋亡，PTL 可通過下調Piezo1 表達降低細胞中Ca2+水平，進而抑制軟骨細胞凋亡。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：馬旋參與研究選題、數據收集整理和論文撰寫，楊開祥參與實驗操作，鄧海參與數據統計學分析，黃玉成參與論文審校和指導。

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