藍莓來源的外泌體樣納米顆粒在MNNG誘導人正常胃黏膜上皮細胞惡性轉化中的干預效應

［摘要］ 目的： 提取藍莓來源的外泌體樣納米顆粒（blueberry derived exosome-like nanoparticles，BELNs）并進行鑒定，探討BELNs在1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguallidine，MNNG）誘導人正常胃黏膜上皮細胞惡性轉化中的干預效應。方法： 采用超速離心法提取BELNs，納米顆粒跟蹤分析儀和透射電鏡分別從粒徑、Zeta電位、形態對獲取的BELNs進行鑒定；激光共聚焦顯微鏡觀察BELNs能否被MNNG誘導的人正常胃黏膜上皮細胞，即胃黏膜上皮細胞轉化細胞（transformed gastric mucosal epithelial cells，TGES-1）內吞；用200、400 μg/mL的BELNs處理TGES-1細胞72 h后，蛋白質印跡法分析干性基因、上皮細胞間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及增殖相關蛋白表達的變化。結果： 納米顆粒跟蹤分析儀和透射電鏡等結果顯示BELNs符合外泌體樣納米顆粒的特征，表明成功提取BELNs；激光共聚焦顯微鏡結果提示BELNs可被TGES-1細胞內吞；蛋白印跡結果表明，400 μg/mL的BELNs抑制TGES-1細胞中N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、同源框蛋白（Nanog） 和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達，增強E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達。結論： BELNs在MNNG誘導人正常胃黏膜上皮細胞惡性轉化中具有明顯的干預效應。

［關鍵詞］ 藍莓來源的外泌體樣納米顆粒；1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍；胃黏膜上皮細胞；惡性轉化；干預效應

［中圖分類號］ R737.14" ［文獻標志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2025）01-0052-04

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230309

［引用格式］宋佳佳， 張軒， 高子涵， 等. 藍莓來源的外泌體樣納米顆粒在MNNG誘導人正常胃黏膜上皮細胞惡性轉化中的干預效應［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2025， 35（1）： 52-55， 61.

［基金項目］江蘇省研究生科研與實踐創新計劃項目（KYCX20_3089）；江蘇大學“青年英才培育計劃”優秀青年骨干教師培育項目；大學生創新訓練項目（202310299476X）

［作者簡介］宋佳佳（2000—），女，碩士研究生；梁照鋒（通訊作者），副教授，碩士生導師，E-mail： liangzhaofeng@ujs.edu.cn

Intervention effect of blueberry derived exosome-like nanoparticles on MNNG-induced malignant transformation of human gastric epithelial cells

SONG Jiajia， ZHANG Xuan， GAO Zihan， XU Wenrong， QIAN Hui， LIANG Zhaofeng

（School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013， China）

［Abstract］ Objective： "Blueberry derived exosome-like nanoparticles （BELNs） were extracted and identified， and the intervention effect of BELNs on the malignant transformation of human normal gastric mucosal epithelial cells induced by （N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguallidine， MNNG） was investigated. Methods： The BELNs were extracted by ultracentrifugation， and the BELNs were identified with particle size， Zeta potential and morphology by nano-particle tracking analyzer and transmission electron microscopy. Laser confocal microscopy was used to observe whether BELNs could be endocytosed by transformed gastric mucosal epithelial cells （TGES-1）. TGES-1 cells were treated with 200 and 400 μg/mL BELNs for 72 h， then Western blotting was used to analyze the expression of stemness genes， epithelial-mesenchymal transition （EMT） and proliferation related proteins. Results： The results of nano-particle tracking analyzer and transmission electron microscopy showed that BELNs was matched with the characteristics of exosome-like nanoparticles. The results of laser confocal microscopy confirmed that BELNs could be endocytosed by TGES-1 cells. Western blotting showed that 400 μg/mL BELNs inhibited the expression of N-cadherin， E-cadherin， Vimentin， Nanog and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and enhanced expression of E-cadherin in TGES-1 cells. Conclusion： BELNs exert a significant intervention effect on human normal gastric mucosal epithelial cells induced by MNNG.

［Key words］ blueberry derived exosome-like nanoparticles; MNNG; gastric epithelial cells; malignant transformation; intervention

胃癌是導致人類死亡的主要惡性腫瘤之一。我國胃癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤第3位，發病和死亡人數居世界之首^［1-2］ 。幽門螺桿菌感染、飲酒、吸煙、高鹽攝入量以及水果和蔬菜攝入量低等都是胃癌發病的高危因素^［3］ 。

N-亞硝基化合物是一種強致癌劑，腌制食品、加工肉制品和高鹽飲食等是其主要來源，N-亞硝基化合物的暴露與胃癌的發生發展密切相關。1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguallidine，MNNG）是研究N-亞硝基化合物致癌機制常用的模式化合物^［4-5］ 。

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是指從細胞膜剝離或由細胞分泌的具有膜結構的囊泡，直徑范圍為40～1 000 nm，在多種生理和病理進程中具有重要的調節作用^［6-7］ 。植物外泌體樣納米顆粒（plant "derived exosome-like nanoparticles，PELNs）具有與哺乳動物外泌體相似的結構和功能。與EVs相比，PELNs具有生物活性獨特、來源廣泛、易被吸收、成本效益高和生物安全性高的特點，適合用于臨床轉化和疾病干預等研究^［8］ 。

藍莓是杜鵑花科越橘屬，含有多酚、花青素和類黃酮等抗氧化成分，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性，可以中和體內自由基的氧化反應，改善代謝功能和認知能力。藍莓中的花青素能夠阻止腫瘤細胞的增殖和擴散，從而抑制癌癥的發生^［9-11］ 。本研究分離提取藍莓來源的外泌體樣納米顆粒（blueberry derived exosome-like nanoparticles，BELNs）并進行鑒定，探討該BELNs在胃黏膜上皮細胞轉化細胞（transformed gastric mucosal epithelial cells，TGES-1）惡性轉化中的干預效應，為藍莓及其外泌體樣納米顆粒在胃癌防治中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養基、胰酶、胎牛血清（美國Gibco公司）；PMSF+RIPA（美國Invitrogen公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術股份有限公司），PVDF膜（德國Millipore公司），PBS（大連美侖生物技術有限公司），0.22 μm無菌濾膜（德國Millipore公司）；N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、增殖細胞核抗原（proliferating "cell nuclear antigen，PCNA）、同源框蛋白（Nanog）、波形蛋白（Vimentin）一抗（美國CST公司），E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、GAPDH（美國Bioworld公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司），ImageQuant LAS4000mini化學發光成像儀、激光共聚焦顯微鏡（日本GE公司），倒置式生物顯微鏡（日本Nikon公司），Nanosight納米顆粒分析儀（德國Particle Metrix公司），透射電子顯微鏡（荷 蘭Philips公司），臺式離心機（德國Eppendorf公司），超速離心機（美國Beckman公司）。

1.2 細胞系及細胞培養

TGES-1細胞由本實驗構建，細胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基中生長，并置于含5% CO2 的37 ℃細胞培養箱中培養。

1.3 BELNs的提取與純化

取適量新鮮藍莓，用雙蒸水洗凈，榨取藍莓汁；將藍莓汁在4 ℃下連續差速離心后取上清液；將取得的藍莓上清液超速離心，4 ℃、150 000× g 離心90 min后 取沉淀；將沉淀重懸于冰PBS中。接著，分別配制15%、30%、45%、60%濃度的蔗糖溶液，與BELNs沉淀懸液一起依次加入離心管中，再進行超速離心，4 ℃、150 000× g 離心120 min；吸取30%～45%蔗糖溶液間的分層，重懸于大量冰PBS中；再次超速離心，4 ℃、150 000× g 離心90 min，所得沉淀重懸于冰PBS，并用0.22 μm的濾膜過濾，獲得無菌的BELNs。

1.4 透射電鏡檢測BELNs形態

取10～20 μL BELNs懸液滴加在載樣銅網上，吸附3 min后用磷鎢酸（pH=6.8）在室溫下負染1 min ，白熾燈下烤干，隨后在透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 納米顆粒跟蹤分析儀檢測BELNs大小

打開Nanosight機器電源預熱約30 min，開啟軟件，純凈水清洗儀器；純凈水稀釋BELNs至合適的比例，充分混勻；使用1 mL注射器吸取稀釋后的BELNs注射到進樣口檢測。

1.6 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對BELNs內吞情況

1.6.1 鋪板 超凈工作臺內，吸取適量DMEM培養基加入12孔板中，用鑷子夾取玻片，使玻片充分黏附于孔底。將對數生長期的TGES-1細胞，按照6 000個/ 孔接種于細胞爬片上，置于含5% CO2 的37 ℃細胞培養箱中培養。

1.6.2 TGES-1細胞內吞Dil標記的BELNs 取Dil染液按1∶1 000比例與BELNs避光孵育30 min，孵育完畢后，將染色后的BELNs吸至超濾管中3 000× g 離心15 min，0.22 μm濾器過濾后，加到12孔板的貼壁細胞中，置于含5% CO2 的37 ℃細胞培養箱中培養24 h。

1.6.3 染色與顯微鏡觀察 將培養24 h后的12孔板用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，每次5 min ；DAPI核染料覆蓋爬片，室溫染色20 min，棄去染液，PBS清洗3次，每次5 min ；封片、固定，置于激光共聚焦顯微鏡（60×）下拍照并保存圖像。

1.7 CCK8篩選BELNs作用的適宜濃度

用DMEM培養基將BELNs稀釋至不同蛋白濃度（0、100、200、400、600和800 μg/mL），通過CCK8檢測BELNs作用TGES-1細胞后的細胞活力。具體步驟：采用預熱的胰酶消化細胞2 min ，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，離心后收集細胞計數，按每孔1×10³ 個細胞接種于96孔板中，每個濃度梯度重復5個孔，每孔加入100 μL培養基，空白對照組采用無細胞的DMEM培養基。在外圍孔添加PBS以防止培養基揮發過度。培養24 h后棄去培養基，沿孔壁重新加90 μL培養基及10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h后讀取450 nm波長下光密度（ D ）值，檢測過程避光，連續檢測3 d。以時間為橫坐標， D （450 nm）值為縱坐標繪制曲線。

1.8 蛋白質印跡檢測干性基因、上皮細胞間充質轉化（EMT）及增殖相關蛋白的表達

分別用200和400 μg/mL的BELNs處理TGES-1細胞72 h，按照蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，并測定蛋白濃度。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質。將蛋白質轉移到0.22 μm "PVDF膜上，在5%脫脂牛奶中封閉1～2 h，然后與GAPDH（1∶2 000）、PCNA（1∶1 000 ）、Nanog（1∶1 000 ）、Vimentin（1∶1 000 ）、N-cadherin（1∶1 000 ）、E-cadherin（1∶1 000 ）在4 ℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，每次5 min；二抗孵育1 h，1×TBST清洗5次，每次10 min，然后通過化學發光分析儀進行檢測。

1.9 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（ x±s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用SNK- q 檢驗， P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BELNs的提取及鑒定

采用超速離心法從新鮮的藍莓中提取BELNs，并通過納米顆粒跟蹤分析儀和透射電鏡分別從粒徑、Zeta電位、形態對獲取的BELNs進行鑒定。蔗糖密度梯度離心純化后出現3個分層（圖1A）。經鑒定，BELNs的平均粒徑為198.6 nm（圖1B），Zeta電位約為-35.19 mV（圖1C）。透射電子顯微鏡觀察提取的BELNs呈現茶托狀的膜性小囊泡結構（圖1D）。

2.2 BELNs能被MNNG誘導的TGES-1細胞內吞

采用Dil熒光染料標記BELNs，DAPI標記細胞核，用標記后的BELNs處理TGES-1細胞24 h后，共聚焦顯微鏡觀察發現，紅色熒光的BELNs能夠被TGES-1細胞內吞到細胞內（圖2）。

2.3 BELNs抑制MNNG誘導TGES-1細胞的EMT進程、干性及增殖能力

用不同蛋白濃度的BELNs處理TGES-1細胞并通過CCK8測定其細胞活力（圖3A），綜合結果考慮，選擇用200和400 μg/mL濃度的BELNs處理72 h。

蛋白質印跡結果顯示，400 μg/mL的BELNs能抑制TGES-1細胞中N-cadherin、Vimentin、Nanog和PCNA蛋白的表達，增強E-cadherin蛋白的表達，從而抑制其EMT進程、干性及增殖能力（圖3B、3C）。

3 討論

由于胃癌早期診斷率和5年生存率仍處于較低水平^［12］ ，探尋胃癌新的早期防治策略尤為重要。研究發現，MNNG等N-亞硝基化合物長期暴露可顯著增加胃癌發病風險^［13-14］ ，但MNNG誘發胃癌的干預策略尚不明確。

近年來，人們開始關注天然植物化學物的生物作用^［15］ 。閆慶韜等^［16］ 研究發現刺槐素可能通過降低血管內皮生長因子的表達進而抑制肺癌A549細胞遷移、侵襲和血管生成。盡管天然植物化學物具有抗癌、防癌作用，但有用藥安全性不高、口服劑量大和生理利用率低等缺點。本研究提取了BELNs，其平均粒徑約為200 nm，具有脂質雙層膜結構，呈茶托狀。相較于植物化學物，BELNs等食用植物來源納米顆粒的生物相容性更好、安全性更高、更易被機體吸收利用。藍莓具有抗癌、抗炎、抗心血管疾病以及保護視力的作用^［17］ 。姜橋等^［18］ 研究發現，藍莓紫檀芪在控制腫瘤細胞增殖、自噬和凋亡方面有顯著作用；并且參與遺傳因子的調控，控制腫瘤細胞與上皮間質之間的轉化。本研究用不同濃度BELNs處理TGES-1細胞，研究結果顯示，400 μg/mL的BELNs能夠降低MNNG誘導的TGES-1細胞N-cadherin、Vimentin、Nanog和PCNA蛋白表達水平，增加E-cadherin蛋白表達水平，抑制了TGES-1細胞的EMT進程、干性及增殖能力，在一定程度上顯示出抗腫瘤效應。

綜上所述，本研究結果初步顯示了BELNs對TGES-1細胞的干預效應，發現BELNs能夠抑制TGES-1細胞的EMT進程、干性及增殖能力。BELNs作為一種從食用植物中提取的外泌體，不僅具有天然的生物活性，來源廣泛，生物相容性高，且在MNNG誘導人正常胃黏膜上皮細胞發生惡性轉化的過程中具有顯著的干預效應，有望成為胃癌早期干預的新興手段。后續研究中將進一步探討干預效應的分子機制，提升BELNs在胃癌防治中的臨床應用價值。

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［收稿日期］ 2023-12-22" ［編輯］ 郭 欣