高效液相色譜法測定荔枝酒中山梨酸含量的不確定度評定

摘 要：目的：評定高效液相色譜法測定荔枝酒中山梨酸含量的不確定度。方法：按照《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）進行檢測，并依據測量不確定度的規程要求，構建數學模型和評估方法，分析不確定度來源并進行計算、合成。結果：荔枝酒中山梨酸含量為

0.178 6 g·kg-1，擴展不確定度為0.011 6 g·kg-1（置信概率P=95%，k=2）。結論：標準物質純度以及標準工作曲線擬合是不確定度的主要來源，測定時應嚴格控制這些因素，以提升檢測結果的準確性。

關鍵詞：不確定度；山梨酸；高效液相色譜；荔枝酒

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Sorbic Acid Content in Litchi Wine by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Yanshao， ZHOU Tingting， TANG Fengqiao， LI Xiaomei， LIN Cailan*

（Lingshan County Product Quality Inspection Center， Qinzhou 535499， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of determination of sorbic acid in litchi wine by high performance liquid chromatography. Method： According to the GB 5009.28—2016， a mathematical model and evaluation method were constructed according to the requirements of the procedure for measuring uncertainty， and the sources of uncertainty were analyzed， calculated and synthesized. Result： The content of sorbic acid in litchi wine was 0.178 6 g·kg-1， and the extended uncertainty was 0.011 6 g·kg-1 （confidence probability P=95%， k=2）. Conclusion： The purity of reference material and the fitting of standard working curve are the main sources of uncertainty， and these factors should be strictly controlled to improve the accuracy of detection results.

Keywords： uncertainty; sorbic acid; high performance liquid chromatography; litchi wine

荔枝酒是以新鮮荔枝為原料，經發酵或浸泡等工藝釀制而成的果酒[1]，其色澤晶瑩，帶有濃郁的荔枝果香[2]，口感醇厚甘甜，既保留了荔枝的風味，又增添了酒的韻味，是一款獨具特色的飲品。受荔枝酒原料本身的熱敏性、易褐變等因素的影響[3]，其易發生酸敗影響口感，當前常在荔枝酒中添加適量的山梨酸以防腐保鮮[4]。山梨酸能抑制微生物生長，延長荔枝酒的保質期，防止酒在儲存和運輸過程中因微生物滋生而變質，能夠確保產品在一定時間內保持較好的品質和口感。但山梨酸添加過量可能對人體產生危害[5]，如過敏反應、影響人體新陳代謝等[6-10]，

因此準確測定荔枝酒中的山梨酸含量可確保產品符合安全標準，保障消費者健康，而且有助于企業規范使用食品添加劑，促進荔枝酒行業健康發展。

為明確測定結果可靠程度及判斷數據質量，本文依照《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）中高效液相色譜法，對荔枝酒中的山梨酸含量進行測定，并根據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），對實驗中各影響因素所引入的不確定度進行評定。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

荔枝酒樣品，超市購買。

甲醇（色譜純），天津市四友精細化學品有限公司；乙酸銨（優級純），上海麥克林生化科技股份有限公司；實驗用水為一級純水，阿修羅超純水機制備；水相微孔濾膜（0.22 μm）；水中山梨酸標準物質[濃度為1.00 mg·mL-1，編號為GBW（E）100007]，中國計量科學研究院。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Ultimate 3000），美國賽默飛世爾公司；電子分析天平（FA2004），上海衡平儀器儀表廠；移液器，德國BRAND公司。

1.3 液相色譜條件

C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇與乙酸銨溶液的混合液（5∶95，V/V）；紫外檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；進樣體積為10 μL；流速為1 mL·min-1。

1.4 樣品前處理

根據《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）第一法液相色譜法測定荔枝酒中山梨酸含量。準確稱取2 g（精確到0.000 1 g）荔枝酒置于50 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，充分搖勻后，移取適量的上清液，采用0.22 μm的水相微孔濾膜進行過濾，從而得到上機待測液。

1.5 山梨酸標準工作溶液的配制

準確移取2.0 mL濃度為1.00 mg·mL-1的山梨酸標準物質溶液，將其置于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，制得濃度為0.2 mg·mL-1的山梨酸標準中間溶液。分別移取0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mL和1.250 mL的山梨酸標準中間溶液，依次置于5 mL容量瓶中，并用純水定容至刻度線，配制成濃度分別為0.005、0.010、0.020、0.030、

0.040 mg·mL-1和0.050 mg·mL-1的標準系列工作溶液。

1.6 數學模型

按照GB 5009.28—2016中液相色譜法，計算荔枝酒中山梨酸含量的公式為

（1）

式中：X為荔枝酒樣品中的山梨酸含量，g·kg-1；ρ為通過標準曲線確定的樣品待測液中山梨酸的質量濃度，mg·L-1；V為樣品的定容體積，mL；m為樣品的稱樣量，g；1 000為換算因子。

1.7 不確定度來源

在測定荔枝酒中的山梨酸含量時，不確定度有諸多來源。①樣品前處理引入的不確定度。②標準溶液配制引入的不確定度。③標準曲線擬合引入的不確定度。④樣品重復性測量引入的不確定度。根據各種不確定度分量繪制來源因果分析圖，如圖1所示。

圖1 不確定度來源因果分析圖

2 結果與分析

2.1 樣品前處理引入的相對標準不確定度

2.1.1 樣品稱量引入的不確定度

荔枝酒樣品稱量2.0 g，查檢定證書，稱量樣品使用的電子天平（FA2004）的精準度為0.000 1 g，

偏載誤差為±0.000 2 g，以均勻分布進行考量，k=。

則在稱量過程中所引入的標準不確定度為

樣品稱量所引入的相對標準不確定度為

2.1.2 樣品定容引入的不確定度

處理樣品時，將搖勻后的樣品用50 mL的A級容量瓶進行定容，根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）可知，50 mL容量瓶的允許誤差為±0.05 mL，此時采用B類評定方法，按照均勻分布考慮，k=。

則樣品定容引入的標準不確定度為

樣品定容引入的相對標準不確定度為

2.1.3 樣品在定容過程中溫度變化引入的不確定度

實驗室溫度嚴格控制在（20±5）℃，即溫度變化量ΔT為5 ℃。在實驗過程中，所使用純水的體積膨脹系數α取值為2.1×10-4 ℃-1，按照均勻分布考慮，k=。

使用50 mL容量瓶進行定容，則溫度變化引入的標準不確定度為

溫度變化引入的相對標準不確定度為

綜合上述3個分量，荔枝酒樣品在進行前處理時引入的相對標準不確定度為

2.2 標準溶液配制引入的相對標準不確定度

2.2.1 標準物質純度引入的不確定度

本實驗所使用的是水中山梨酸標準品，經查閱標準物質證書后得知，其濃度值為1.00 mg·mL-1，此標準品的相對擴展不確定度為2%，包含因子k=2。

則山梨酸標準物質純度引入的相對標準不確定度為

2.2.2 配制標準中間工作液引入的不確定度

用移液器（規格為500～5 000 μL）移取2.0 mL山梨酸標準品至10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，配制成0.2 mg·mL-1的山梨酸標準中間工作液。查此移液器的檢定證書，顯示2.0 mL校準點對應的標準不確定度U=0.004 mL（k=2），考慮到移取的體積小，溫度效應忽略不計。

則使用10 mL容量瓶定容配制標準中間工作液引入的相對標準不確定度為

2.2.3 配制標準系列工作曲線溶液引入的不確定度

用移液器（規格為100～1 000 μL）分別移取山梨酸標準中間溶液0.125、0.250、0.500、0.750、

1.000 mL和1.250 mL至5 mL容量瓶中，用純水定容至刻度線，即可得到相應的各點標準系列工作曲線濃度。查此移液器的檢定證書，因移液器采用多點校準方法進行檢定，所以在移取不同體積時具有不同的標準不確定度。配制標準工作溶液過程中移液器引入的相對標準不確定度結果見表1。

根據表1中計算得到的各相對標準不確定度，考慮到移取的體積小，溫度效應忽略不計，在此情況下，標準工作溶液配制過程中移液器引入的合成相對標準不確定度為

綜合上述3個分量，山梨酸標準溶液在配制過程中所引入的相對標準不確定度為

2.3 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度

本實驗配制了6個不同濃度梯度的山梨酸標準工作液，并對荔枝酒樣品進行了6次平行測定。運用最小二乘法，對數據進行擬合操作，經擬合后得到標準工作曲線方程為y=1 175.5x-0.000 03，截距a=

-0.000 03，斜率b=1 175.5，線性相關系數為0.999 7。測得的峰面積與樣品濃度結果見表2。

標準工作溶液峰面積殘差的標準偏差以及線性擬合引入的標準不確定度計算公式分別為

（2）

（3）

式中：b為標準曲線斜率，b=1 175.5；p為被測樣品的測定次數，p=6；n則是山梨酸標準系列溶液的測定次數，n=6；Ai為峰面積；Ay為標準峰計算值；為

荔枝酒樣品濃度的平均值，=0.007 47 mg·mL-1；為山梨酸標準溶液濃度平均值，=0.025 8 mg·mL-1；Ci為系列標準溶液濃度值，mg·mL-1。

代入數據，得到標準工作溶液峰面積殘差的標準偏差為

標準曲線擬合引入的標準不確定度為

則標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為

2.4 樣品重復性測量引入的相對標準不確定度

本實驗考察了儀器測試穩定性，對荔枝酒樣品中的山梨酸含量進行6次重復性測定，所得結果

見表3。

由表3數據可得，樣品重復性測量引入的標準不確定度為

則其相對標準不確定度為

2.5 合成標準不確定度及擴展不確定度

采用高效液相色譜法測定荔枝酒中的山梨酸含量，其不確定度的來源及各分量的匯總結果見表4。

則荔枝酒樣品中測定山梨酸含量的合成相對標準不確定度為

樣品中山梨酸含量的平均值X=0.178 6 g·kg-1，則其合成標準不確定度為

取置信區間為95%，包含因子k=2，則其擴展不確定度為

因此，在置信概率為95%，k=2時，本實驗荔枝酒中的山梨酸含量的測量不確定度可表示為（0.178 6±

0.011 6）g·kg-1，k=2。

3 結論

本研究對高效液相色譜法測定荔枝酒中山梨酸含量的不確定度進行評定。經分析可知，在測定過程中，由山梨酸標準工作曲線擬合引入的不確定度影響最為顯著，山梨酸標準溶液配制所帶來的不確定度次之?；诖耍诤罄m的實際測量中，為有效提升測定的準確度，應選用相對擴展不確定度較低的標準物質，增加標準曲線的濃度點數量，從而提高曲線的準確性。同時，對每個濃度點進行多次測量，以減少測量過程中的隨機誤差。此外，還需定期對測定系統進行校準和維護。采取上述措施，能夠進一步降低測定結果的不確定度，切實提高結果的準確性。

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作者簡介：張彥紹（1986—），男，廣西靈山人，本科，工程師。研究方向：化學工程、食品檢驗及質量控制。

通信作者：林彩蘭（1983—），女，廣西靈山人，本科，工程師。研究方向：食品工程、食品檢驗及質量控制。E-mail： 84981262@qq.com。