一例鸚鵡肺炎克雷伯菌感染的診斷報告

摘 要：山東省某養殖場飼養的12日齡鸚鵡出現呼吸困難、鼻腔內充滿干酪樣分泌物等癥狀，采集死亡鸚鵡的鼻腔內分泌物和肺臟組織分離細菌，通過生化試驗、16S rDNA測序和系統進化樹分析，初步證實該病由肺炎克雷伯菌肺炎亞種所致。藥物敏感性試驗結果顯示，該分離菌對大部分藥物耐受，僅對氟苯尼考、氧氟沙星等藥物高度敏感，對多粘菌素B、阿米卡星等藥物中度敏感。本研究為鸚鵡肺炎克雷伯菌感染的臨床診治提供了理論依據和參考。

關鍵詞：鸚鵡；肺炎克雷伯菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號：S858.39 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2025）02-0037-06

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）是一種引起多種動物和人類肺炎的革蘭氏陰性條件性病原菌，屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬[1]。肺炎克雷伯氏菌分為肺炎、臭鼻和鼻硬結3個亞種，其中肺炎亞種廣泛存在于人和動物的上呼吸道和腸道，當機體抵抗力降低時便會誘發疾病[2]。已有報道鸚鵡感染肺炎克雷伯氏菌后臨床上表現出伸頸、呼吸困難、鼻腔堵塞、肺炎等病癥，嚴重影響了鸚鵡養殖業的發展[3]。2023年山東省某養殖場飼養的12日齡鸚鵡出現呼吸困難、鼻腔內充滿干酪樣分泌物等癥狀，剖檢發現肺炎、肝臟變化不明顯。經細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗、基因測序和系統進化樹鑒定分離菌為肺炎克雷伯菌肺炎亞種感染，經藥敏試驗篩選出敏感藥物進行治療，該鸚鵡群疫情很快得到控制，現總結如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源

采集山東省某養殖場12日齡發病鸚鵡的鼻腔粘液和肺組織。

1.2 主要試劑

pMD-18T克隆載體，購自TaKaRa公司；PCR擴增試劑盒，均購自Axygen公司；細菌微量生化管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購自北京艾博利德商貿有限公司；LB培養基、麥康凱培養基及其他試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離 無菌采集發病鸚鵡的鼻腔組織粘液在LB固體培養基上劃線培養，置37 ℃恒溫培養箱培養18～24 h；挑取單菌落在麥康凱培養平板鑒別培養，觀察菌落生長情況；革蘭氏染色后鏡檢觀察。

1.3.2 生化試驗 挑取分離菌（標記為：KP-parrot）單個菌落，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[4]，按照生化管說明書進行生化試驗。

1.3.3 16S rDNA序列測定及分析 挑取分離菌KP-parrot的單菌落懸浮于50 μL雙蒸水作為模板，使用16s rDNA通用引物：上游引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，按照以下比例配制反應體系：模板1 μL，上下游引物 （ 20 pmol/μL） 各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，補充去離子水至25 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，

72 ℃ 1 min，共進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。將陽性PCR產物送生工生物工程 （ 上海） 股份有限公司測序。

將序列與GenBank中登錄的產酸克雷伯菌株、產氣克雷伯菌、變棲克雷伯菌、肺炎克雷伯菌肺炎亞種、肺炎克雷伯菌臭鼻亞種、肺炎克雷伯菌鼻硬結亞種等肺炎克雷伯菌核苷酸序列對比，見表1；使用MEGA 7.0制作系統發育樹。

收稿日期：2024-08-23

基金項目：山東省重點研發計劃（2022CXGC010606，2022CXPT010-04）；山東省家禽產業技術體系首席專家項目（SDAIT-11-01）；

2024年山東省農業重大技術協同推廣計劃（SDNYXTTG-2024-09）

第一作者：黃濤（2000—），碩士研究生，獸醫專業，E-mail：erbercom@163.com

通信作者：馬秀麗（1978—），研究員，主要從事禽病診斷與防治技術研究，E-mail：maxiuli1978@163.com

1.3.4 藥物敏感試驗 按照WHO推薦的瓊脂紙片擴散法（K-B）對分離菌進行藥敏試驗，結果按照NCCLS標準做出判定。所用的檢測藥物有氟苯尼考、強力霉素、四環素、恩諾沙星、氧氟沙星、慶大霉素、多粘菌素B、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、紅霉素、林可霉素、復方新諾明、恩諾沙星等。根據藥敏結果選擇敏感藥物治療。

2 結果

2.1 細菌分離與培養結果

患病鸚鵡的鼻腔液在LB固體培養基上劃線，37 ℃培養24 h后可見圓形、隆起、灰白色、光滑濕潤的菌落。挑取單菌落在麥康凱培養平板上劃線，可見粉色、大而隆起、光滑濕潤菌落，48 h后相鄰菌落融合成膿汁樣；革蘭氏染色后鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，單個、成對或短鏈狀排列的短小桿狀，菌體小，約（0.5～0.8）μm×（1.5 ～2.0）μm，見圖1。

2.2 生化試驗結果

生化試驗結果見表2。分離菌KP-parrot能利用麥芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、尿素，判為陽性；不能利用枸櫞酸鹽，判為陰性；不產生硫化氫，判為陰性。

2.3 16S rDNA測序分析

通過PCR擴增出的目的片段大小約1 200 bp，見圖2；測序結果經NCBI網站BLAST比對，與肺炎克雷伯菌的核苷酸同源性高達99%。

利用Mega7.0軟件對分離菌KP parrot及其它參考序列進行系統發育樹分析，結果顯示KP parrot菌株與肺炎克雷伯菌肺炎亞種AAM7株（GenBank：MK512007）分布在同一分支上，親緣關系最為接近，見圖3。結合細菌特征及生化試驗結果，初步鑒定該菌為肺炎克雷伯菌肺炎亞種（subsp. pneumoniae）。

2.4 藥敏試驗結果

藥敏結果顯示分離菌對于氟苯尼考、氧氟沙星高度敏感；對多粘菌素B、阿米卡星表現出中度敏感；對強力霉素、四環素、卡那霉素、慶大霉素、恩諾沙星、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、紅霉素、鏈霉素、林可霉素、復方新諾明等均表現為耐藥，結果見表3。

根據藥敏試驗結果選擇敏感藥物氟苯尼考溶液治療，按照說明書推薦劑量連續用藥5 d，發病鸚鵡的呼吸道癥狀緩解，同時配合做好環境消毒，有效控制了該病。

3 討論

肺炎克雷伯菌在自然界的分布極為廣泛，但由于其作為一種條件致病性病原菌，因此未受到業內人士的廣泛關注。近年來，隨著養殖業的迅速發展，集約化養殖規模逐漸增大，各種動物疫病種類也層出不窮。一旦動物機體免疫能力下降，肺炎克雷伯菌這類條件性致病菌便有機可乘。研究發現，由于抗生素的大量使用導致肺炎克雷伯菌的耐藥性呈現逐漸增強的趨勢[5-6]，因肺炎克雷伯菌感染動物的病例屢見不鮮，如禽類尤其是鸚鵡感染后會流鼻涕、眼周水腫、鼻孔內出現干酪樣堵塞物、呼吸困難以及肝臟點狀壞死、心臟及皮下存在黃色的膠凍樣滲出物[7]；羊感染后肺部嚴重充血，肝脾淤血腫大[8]；鼠感染后心肌纖維腫脹、脾小梁水腫、肺部毛細血管擴張[9]，嚴重阻礙了養殖業的發展。

本試驗從鸚鵡鼻腔粘液中分離出疑似病原菌，對分離菌的形態、生化特性進行驗證，發現該菌的生化鑒定結果符合肺炎克雷伯菌的生化特性，與左偉等[10]的試驗結果相一致。通過16S rDNA測序和系統發育樹分析，進一步確定分離株為肺炎克雷伯菌肺炎亞種。通過藥敏試驗結果發現，分離株僅對部分四環素類、喹諾酮類高度敏感，對部分喹諾酮類、氨基糖苷類和多肽類藥物中度敏感，對大部分藥物不敏感，其藥敏結果與符德佳等[11]的試驗結果存在一定的差異，表明不同區域不同動物所分離的肺炎克雷伯菌對藥物的敏感性也不盡相同，實際生產中最好通過藥敏試驗選擇敏感藥物，以減少抗生素的濫用，避免耐藥細菌的產生。

通過后續的跟蹤觀察，養殖戶使用氟苯尼考溶液治療后，病情得到了很好的控制。本研究對鸚鵡肺炎克雷伯菌的有效防控具有一定的借鑒意義。

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Diagnosis of Parrots Infected with Klebsiella Pneumoniae

HUANG Tao1， LIU Jinfeng2， LIN Zhongyin3， JU Yan3， JIANG Yifei3，

ZHAO Qiaoya3， MA Xiuli3

（1.Nanjing Agricultural University，College of Veterinary Medicine，Nanjing 210095，China;

2. Yinan County Animal Husbandry Bureau，Yinan 276300，China;

3.Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，China）

Abstract： Parrots， bred in a farm in Shandong Province， exhibited a series of symptoms such as respiratory distress and caseous-like secretions in the nasal cavity. The nasal secretions and lung tissue from deceased parrots were collected for bacterial isolation. It was preliminarily confirmed that this case was caused by subspecies of Klebsiella pneumoniae through biochemical assays， 16S rDNA sequencing， and phylogenetic analysis. Antimicrobial susceptibility test showed that this strain is resistant to most antibiotics but highly sensitive to florfenicol and ofloxacin， while exhibiting moderate sensitivity to polymyxin B and amikacin. This study provides a theoretical evidence and reference for the clinical diagnosis and treatment of Klebsiella pneumoniae infections in parrots.

Keywords： Parrot; Klebsiella pneumoniae; Isolation and identification; Antimicrobial susceptibility test