麝香保心丸干預異丙腎上腺素誘發心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機制

摘要" 目的：探討麝香保心丸通過拮抗心肌細胞凋亡改善異丙腎上腺素（ISO）誘發的心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用。方法：30只SD雄性大鼠隨機分成對照組、模型組（ISO組）、麝香保心丸組。以腹腔注射ISO［50 mg /（kg·d）］2 d 構建心肌梗死大鼠模型，麝香保心丸組給予麝香保心丸45 mg /（kg·d） 灌胃，ISO組和對照組同時給予等量的蒸餾水灌胃。干預6周后處死大鼠，以 Masson 染色檢測心肌膠原沉積，Tunel染色觀察大鼠心肌細胞凋亡情況，采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測各組大鼠心肌組織中Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）、α -平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Bax、B 細胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-xl、半胱氨酸天冬氨酸氨基轉移酶（Caspase）-3、Caspase-9蛋白表達水平。結果：與對照組相比，ISO組存在明顯膠原沉積和心肌纖維化，心肌細胞凋亡明顯增多，心肌中α-SMA、Collagen Ⅲ、Bax、Caspasae-3、Caspase-9表達明顯增加（P＜0.05），Bcl-2、Bcl-xl表達明顯降低（P＜0.05）。與ISO組相比，麝香保心丸組膠原沉積明顯降低，細胞凋亡明顯減少，心肌中α-SMA、Collagen Ⅲ、Bax、Caspasae-3、Caspase-9表達明顯降低（P＜0.05），Bcl-2、Bcl-xl表達明顯增加（P＜0.05）。結論：麝香保心丸能改善心肌梗死大鼠的心肌纖維化，其機制可能與調控Bcl-2家族蛋白和Caspase介導的凋亡信號通路有關。

關鍵詞" 心肌梗死；心肌纖維化；麝香保心丸；細胞凋亡；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.03.005

The Mechanism of Shexiang Baoxin Pill in the Intervention of Myocardial Fibrosis in Rats with Myocardial Infarction Induced by Isoproterenol

LAI Qi^1，2， YANG Ting^1，2， CHU Chun^1，2， YANG Jun³

1.School of Pharmaceutical Science of University of South China， Hengyang 421001， Hunan， China; 2.The Second Affiliated Hospital，Hengyang Medical School，University of South China， Hengyang 421001， Hunan， China; 3.First Affiliated Hospital， Hengyang Medical School， University of South China

Corresponding Author" CHU Chun， E-mail： 1996020012@usc.edu.cn

Abstract Objective：To observe the effect of Shexiang Baoxin Pill（SBP） on improving myocardial fibrosis in rats with isoproterenol（ISO）-induced myocardial infarction by antagonizing myocardial cell apoptosis.Methods：Thirty male SD rats were randomly divided into three groups：control group（Control），model group（ISO），and Shexiang Baoxin Pill intervention group（ISO＋SBP）.An acute myocardial infarction rat model was established by intraperitoneal injection of ISO[50 mg/（kg·d）] for 2 days.The ISO＋SBP group was administered SBP at a dose of 45 mg/（kg?d） dissolved in distilled water via gavage，while the ISO and Control groups were given an equal volume of distilled water.After 6 weeks of intervention，the rats were sacrificed. Myocardial collagen deposition was detected using Masson staining，apoptosis of myocardial cells was observed using Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling（TUNEL） staining，and the expression levels of Collagen Ⅲ，α-smooth muscle actin（α-SMA），Bax，Bcl-2，Bcl-xl，Caspase-3，and Caspase-9 proteins in myocardial tissue were measured using Western Blotting.Results：Compared with the control group，the ISO group showed significant collagen deposition and myocardial fibrosis，a marked increase in the number of apoptotic cells in the myocardium，and a significant increase in the expression of α-SMA，Collagen Ⅲ，Bax，Caspase-3，and Caspase-9（P＜0.05），with a significant decrease in the expression of Bcl-2 and Bcl-xl（P＜0.05）.Compared with the ISO group，the ISO＋SBP group exhibited a significant reduction in collagen deposition and apoptosis，as well as a significant decrease in the expression of α-SMA，Collagen Ⅲ，Bax，Caspase-3，and Caspase-9，and a significant increase in the expression of Bcl-2 and Bcl-xl，with statistically significant differences（P＜0.05）.Conclusion：Shexiang Baoxin Pill can ameliorate myocardial fibrosis in rats with myocardial infarction，and its mechanism may be associated with the regulation of the apoptosis signaling pathway mediated by Bcl-2 family proteins and Caspases.

Keywords" myocardial infarction; myocardial fibrosis; Shexiang Baoxin Pill; cell apoptosis; experimental study

急性心肌梗死是由不穩定缺血綜合征引起的心肌壞死，具有潛在的高發病率和高死亡率^［1］，心肌梗死期間的缺血性細胞死亡導致多項修復反應，其中心肌纖維化是重要的病理病變，心肌纖維化過程中心肌膠原纖維過度收縮積聚、心臟組織中膠原數量明顯升高或膠原成分改變，受損組織會被成纖維細胞和肌成纖維細胞產生的纖維化瘢痕取代^［2］，心肌纖維化已被確定為心肌梗死的一個主要危險因素，使心肌梗死病人易發生心源性猝死，并提高了總體死亡率，因此，延緩心肌纖維化是改善心肌梗死預后的關鍵^［3］。細胞凋亡是急性心肌梗死和心力衰竭的一個重要病理特征，已有研究證明急性心肌梗死后早期和晚期存在細胞凋亡，B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma，Bcl-2）和半胱氨酸天冬氨酸氨基轉移酶（Caspase）家族蛋白作為調節細胞凋亡和存活的重要蛋白，與多種心血管疾病有關，因此，抑制凋亡改善心肌纖維化對心肌梗死病人至關重要。麝香保心丸是由麝香、人參、牛黃、肉桂、蘇合香、蟾酥、冰片組成的中藥復方制劑，麝香保心丸廣泛用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾病^［4］。但麝香保心丸對心肌梗死后心肌纖維化的影響及機制尚不明確。本研究擬建立急性心肌梗死大鼠模型，予以麝香保心丸干預，探討麝香保心丸對Bcl-2家族蛋白和Caspase依賴的凋亡信號通路的影響及干預心肌纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器

30只8 周齡無特定病原體（SPF）級雄性 SD 大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量（240±20）g，飼養于南華大學實驗動物中心，所有動物實驗操作及規程遵循南華大學實驗動物管理規定和相關實驗動物法規，本研究經南華大學動物倫理審查委員會批準（USC202212DS73）。異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）購自大連美侖生物有限公司，麝香保心丸購自上海和黃藥業。Ⅲ型膠原（collagen type Ⅲ，Collagen Ⅲ）、α -平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Bcl-2、Bcl-2 相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗及兔源、鼠源二抗均購自武漢 Proteintech 公司，Masson染色試劑盒購自湖南艾碧維生物科技有限公司，細胞裂解液和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。小型電泳儀、轉膜儀和BIO-RAD XRS＋凝膠成像系統購自美國伯樂生命醫學產品公司。

1.2 心肌梗死大鼠模型的構建

30只SPF及雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組（ISO組）、麝香保心丸組。適應性喂養1周后，ISO組、麝香保心丸組均采用連續2 d腹腔注射50 mg/（kg·d）ISO構建心肌梗死大鼠模型，ISO組、對照組連續2 d腹腔注射等量生理鹽水，麝香保心丸組給予麝香保心丸45 mg/（kg·d），用去離子水研磨成勻漿灌胃，持續6周。

1.3 Masson染色

心肌組織用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水后石蠟包埋，切片機制成4 μm薄片，按照Masson染色試劑盒（Abiowell Biotech Co，Ltd，Hunan，長沙）說明書進行染色，密封，光鏡下觀察染色情況。

1.4 Tunel染色

大鼠灌注生理鹽水，取出心臟，浸泡在4%多聚甲醛中，梯度酒精脫水制成石蠟切片，按照Tunel染色試劑盒（凱基生物）說明書進行封閉，通透，染色操作，光鏡下觀察染色情況。

1.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

Western Blot實驗檢測大鼠心肌組織纖維化相關蛋白Collagen Ⅲ及α-SMA表達水平。取大鼠左心室心肌組織樣本，用含蛋白酶抑制劑冷RIPA裂解液裂解大鼠心肌組織，離心后收集上清。BCA蛋白定量試劑盒進行定量，95 ℃加熱10 min使蛋白變性，配置10%和12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），進行電泳，轉膜，封閉，α-SMA、Collagen Ⅲ、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3、Caspase-9（稀釋比1∶1 000）GAPDH（稀釋比1∶9 000）一抗4 ℃孵育過夜，經 TBST溶液洗膜（5 min×3次），通過用辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔二抗（稀釋比1∶8 000） 37 ℃恒溫孵育1 h后再用 TBST 漂洗（5 min×3次）用強化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液，使用BIO-RAD XRS＋成像系統采集圖像信號，并使用ImageJ軟件分析相關數據，以GAPDH為內參，目的條帶與內參條帶的灰度比值代表蛋白表達水平。

1.6 統計學處理

采用GraphPad Prism 9.0統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用最小顯著差異分析法（LSD）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織Masson染色結果

藍染部分為膠原沉積，與正常對照組相比，ISO組藍染部分顯著增加，心肌組織排列無序，膠原沉積明顯，麝香保心丸組心肌組織相較ISO組藍染部分顯著減少，膠原纖維沉積減少，心肌細胞排列相對有序，而經SBP干預后大鼠與正常大鼠心肌膠原沉積無明顯差異。詳見圖1。

2.2 各組心肌組織中Collagen Ⅲ和α-SMA蛋白表達水平比較

與對照組相比，ISO組心肌組織中α-SMA和Collagen Ⅲ蛋白表達水平升高（P＜0.05）；麝香保心丸組心肌組織中α-SMA和Collagen Ⅲ蛋白表達水平低于ISO組（P＜0.05），而麝香保心丸組與對照組心肌組織中α-SMA和Collagen Ⅲ蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2。

2.3 3組大鼠心肌Tunel染色結果

在光學顯微鏡下，正常心肌核呈藍色，而凋亡陽性心肌核呈棕黃色。與對照組相比，ISO組棕褐色區域顯著增加，凋亡細胞顯著增多，麝香保心丸組心肌組織相較ISO 棕褐色區域顯著減少，凋亡細胞減少。對照組與麝香保心丸組棕褐色區域無明顯差異。詳見圖3。

2.4 3組心肌組織中Bcl-2、Bcl-xl和Bax蛋白表達比較

與對照組比較，ISO組心肌組織中 Bax蛋白表達水平升高（P＜0.05），Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達水平下降（P＜0.05）；麝香保心丸組心肌組織中Bcl-2、Bcl-xl和Bax蛋白表達水平與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與ISO組比較，麝香保心丸組大鼠心肌組織中Bax 蛋白表達水平降低（P＜0.05），Bcl-2 和Bcl-xl蛋白表達水平升高 （P＜0.05）。詳見圖4。

2.5 3組心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達比較

與對照組比較，ISO組心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平升高（P＜0.05），麝香保心丸組大鼠心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與ISO組比較，麝香保心丸組大鼠心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平降低（P＜0.05）。詳見圖5。

3 討論

急性心肌梗死是導致病人死亡的主要疾病之一。從2005年開始，我國急性心肌梗死病人死亡率一直呈快速上升趨勢^［5］。急性心肌梗死可導致廣泛的心肌壞死和收縮力降低，誘發心功能不全和各種惡性并發癥，從而嚴重影響病人的健康和生活質量^［6］。而麝香保心丸來源于宋代名方蘇合香丸，全方溫寒并用，以溫為主，以補為輔，通補兼施，均作用于心脈，共奏芳香溫通、益氣強心之功^［7］。已有研究顯示，麝香保心丸可降低心血管事件的發生率，減少心絞痛發作次數，改善中醫證候^［8］。但麝香保心丸能否改善心肌梗死后心肌纖維化及其內在機制目前并不十分清楚。

本研究通過腹腔注射ISO建立了大鼠心肌梗死模型，進行Masson染色揭示了心肌纖維化的變化。心肌纖維化在急性心肌梗死的發展過程中扮演著極其重要的角色，心臟纖維化是一種以細胞外基質（ECM）蛋白過度沉積為特征的病理反應。心肌梗死后由于心肌細胞的丟失，心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，cFB）逐漸替代原有心肌細胞，這些成纖維細胞降解現有的基質并沉積多余的纖維和非纖維狀 ECM 蛋白，取代心肌細胞，從而導致心肌纖維化并降低心肌的收縮能力和順應性，對心肌造成不可逆的影響^［9-10］。防止心肌纖維化對改善心肌梗死預后具有重要意義。成纖維細胞中 α-SMA 表達上調和膠原蛋白合成增加是心肌纖維化發生的主要原因^［11］。在本研究中，經麝香保心丸干預可減少心肌組織中α-SMA 和 Collagen Ⅲ蛋白表達，改善間質間異常膠原蛋白沉積，從而改善心肌梗死大鼠心肌纖維化。

已有研究證實，急性心肌梗死后早期和晚期都存在心肌細胞凋亡，細胞凋亡是急性心肌梗死中細胞死亡的主要形式^［12］，細胞凋亡是一種基因調控的死亡過程，尤其是Bcl-2和Caspase等調節蛋白在其中發揮重要作用，Bcl-2家族在線粒體功能障礙引發的內在凋亡途徑中起關鍵作用^［13］。Bcl-2 是一種細胞凋亡抑制劑，在非梗死心肌組織中不表達，Bax 是 Bcl-2 家族的成員，當過度表達時，會加速細胞凋亡，還可對抗 Bcl-2 的凋亡抑制作用^［14］。而在本研究中，心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡明顯增加，Bax表達明顯升高，Bcl-2和Bcl-xl明顯下降，給予麝香保心丸干預后則可逆轉細胞凋亡及Bcl家族相關凋亡蛋白的變化。Caspase存在于胞漿中，目前發現的Caspase有14種，參與調節多種生物學過程與細胞凋亡密切相關^［15］，過量的活性氧產生導致Bax通透線粒體外膜，促使線粒體細胞色素的釋放，細胞色素可加速凋亡的蛋白水解酶激活因子-1（APAF-1）和Caspase-9形成凋亡體，從而觸發Caspase-3的激活^［16］。在本研究中，Caspase-9和Caspase-3在心肌梗死大鼠表達明顯增加，而給予麝香保心丸干預后亦可拮抗Caspase相關蛋白的上調。

綜上所述，麝香保心丸拮抗心肌細胞凋亡改善心肌梗死后大鼠心肌纖維化，并與調控Bcl-2家族蛋白和Caspase依賴的凋亡信號通路有關。

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（本文編輯 郭懷印）

基金項目 國家自然科學基金項目（No.82074236）；湖南省自然科學基金青年基金項目（No.2022JJ40399）；湖南省自然科學基金委員會科衛聯合項目（No.2021JJ70116）

通訊作者 褚春，E-mail：1996020012@usc.edu.cn

引用信息 賴琦，楊婷，褚春，等.麝香保心丸干預異丙腎上腺素誘發心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機制［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2025，23（3）：359-363.