核苷酸促進(jìn)殺菌抗生素有效性的研究

摘 要：隨著抗生素出現(xiàn)耐藥性，越來(lái)越多的感染變得難以治療。因此，需要新的抗生素或替代方法來(lái)對(duì)抗抗生素難治菌。本研究采用細(xì)菌CFUs計(jì)數(shù)法，來(lái)探討核苷酸與抗生素聯(lián)合治療革蘭氏陰性病原體的佐劑潛力，通過(guò)激活細(xì)菌代謝，使耐受菌轉(zhuǎn)化為代謝活性菌，恢復(fù)對(duì)抗生素殺滅的敏感性，增強(qiáng)對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性，為克服耐藥菌提供了一條新的途徑。

關(guān)鍵詞：核苷酸；殺菌抗生素；有效性

耐藥性通常被認(rèn)為是一種藥物難治的狀態(tài)，細(xì)菌對(duì)這種狀態(tài)具有遺傳敏感性，但對(duì)治療具有表型耐受性。耐受性還可以促進(jìn)基因型耐藥性的出現(xiàn)，從而在使慢性和復(fù)發(fā)性感染永久化方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，傳統(tǒng)的治療耐藥菌的方法在面對(duì)耐藥菌時(shí)效果不佳。于是，本文使用單用抗生素或與5種核苷酸聯(lián)合使用后進(jìn)行體內(nèi)外抑菌實(shí)驗(yàn)，為克服耐藥菌提供了一條新的途徑。

1 材料與試劑

第一，菌種：本研究采用實(shí)驗(yàn)室染色大腸埃希菌ATCC 25922和臨床分離大腸埃希菌B2（blaNDM-5+mcr-1）、腸道沙門(mén)氏菌ATCC13076、鮑曼不動(dòng)桿菌19606和銅綠假單胞菌PA14。

第二，藥品與試劑：氨芐西林，卡那霉素，環(huán)丙沙星，美羅培南，粘菌素均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；WST-8試劑盒（中國(guó)北京）；MH 液體培養(yǎng)基，MH 固體培養(yǎng)基，均購(gòu)自上海生工生物有限公司；抗生素從中國(guó)獸藥檢驗(yàn)所獲得，其他化學(xué)試劑從TCI化學(xué)品（日本）購(gòu)買(mǎi)。

第三，儀器與設(shè)備：高壓滅菌鍋 YXQ.SGH.280（蘇州華線） 、隔水式恒溫培養(yǎng)箱 GNP-9080（上海精宏）、超凈臺(tái) SW-CJ-IF （蘇州凈化）、酶標(biāo)儀 M20 （上海帝肯）、電子天平 MP2000D（上海精科） 恒溫?fù)u床 THZ-82A （金壇文華）、微孔濾膜 0.22 μm（天津津騰）、冰箱海爾 BCD-290W （青島）、移液器 （Thermo，USA）、96 孔聚苯乙烯板（Corning-3915）、麥?zhǔn)媳葷峁埽ū本┨彀玻?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 核苷酸促進(jìn)殺菌抗生素的有效性

第一，試驗(yàn)前的準(zhǔn)備。一是抗菌藥液的配制：參考2018版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）指南，采用滅菌生理鹽水對(duì)藥液進(jìn)行配制。稱(chēng)取相應(yīng)抗生素粉劑后加溶劑至

5 mL，最終配制為濃度為1 280 μg/mL 的抗生素貯存液。配置好的藥液須用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

二是培養(yǎng)基配制：MH培養(yǎng)基：稱(chēng)取粉狀培養(yǎng)基15 g，加入超純水500 mL混勻，在121 ℃、15 min條件下高壓蒸汽滅菌，取出備用。TSB培養(yǎng)基：稱(chēng)取粉狀培養(yǎng)基15 g，加入超純水500 mL混勻，在121 ℃、15 min條件下高壓蒸汽滅菌，取出后加入10％小牛血清與磷酸化輔酶A激酶，備用。

三是菌液的復(fù)蘇與保存：細(xì)菌的復(fù)蘇、接種：從-20 ℃的冰箱中取出凍干菌種，放置在室溫下待其復(fù)蘇。點(diǎn)燃酒精燈，在火焰旁用接種環(huán)分別將大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌B2接種于MH肉湯中，并將其置于在37 ℃，

200 r/min條件下的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。稀釋?zhuān)簩⑦^(guò)夜大腸埃希菌按1：1 000稀釋成5 mL新鮮的MHB，培養(yǎng)至指數(shù)期（4 h）或固定期（8 h）。保存：若制備的菌液過(guò)多，可將多余的菌液取1 mL加入 50％甘油中，放入-20 ℃冰箱中保藏，以備下次使用。

第二，預(yù)試驗(yàn)。為了研究核苷酸對(duì)革蘭氏陰性菌抗菌活性的影響，選擇了一株標(biāo)準(zhǔn)敏感的大腸埃希菌ATCC 25922和一株臨床分離的多重耐藥大腸埃希菌B2，測(cè)定環(huán)丙沙星在有或無(wú)核苷酸情況下的MIC用來(lái)評(píng)價(jià)四種核苷酸與環(huán)丙沙星之間的藥物相互作用，通過(guò)計(jì)算5種核苷酸處理后的細(xì)菌存活率來(lái)評(píng)估環(huán)丙沙星對(duì)不同生長(zhǎng)階段細(xì)菌的殺滅作用（10倍MIC）。發(fā)現(xiàn)5種核苷酸單獨(dú)對(duì)大腸埃希菌ATCC 25922指數(shù)期沒(méi)有殺菌作用，反而促進(jìn)了固定期細(xì)菌的生長(zhǎng)。然而，胸腺嘧啶和環(huán)丙沙星的聯(lián)合使用顯著降低了1-log10以上細(xì)菌的存活率，且與生長(zhǎng)期無(wú)關(guān)（圖1A）。對(duì)于大腸埃希菌B2，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤對(duì)指數(shù)期和固定期細(xì)菌的增強(qiáng)作用最強(qiáng)，2-log10以上的環(huán)丙沙星增強(qiáng)作用最強(qiáng)。同樣，胸腺嘧啶也增強(qiáng)了大腸埃希菌B2的抗生素殺滅作用（圖1B）。腺嘌呤/胸腺嘧啶和環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用顯著降低了大腸埃希菌B2的存活率（圖1C）。因此，我們選用胸腺嘧啶作為研究增強(qiáng)抗生素有效性的對(duì)象。

第三，微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度。根據(jù)CLSI指南，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定不同抗生素的MIC值。首先，將MH肉湯加入96孔板中，每孔加100 μL。然后，在前三排的第一孔中加入100 μL的藥液并對(duì)其進(jìn)行二倍稀釋。再在每一孔中加入100 μL菌液[1]。最后，在后兩排做陰性（僅加肉湯不加菌液）和陽(yáng)性對(duì)照（加菌液不加藥液），并將滴加好的96孔板放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

第四，核苷酸加入培養(yǎng)基后抗生素時(shí)間殺菌曲線。為了評(píng)價(jià)不同氨基酸對(duì)大腸埃希菌B2殺菌效果的影響，將環(huán)丙沙星（10倍MIC）處理4 h后的存活細(xì)胞進(jìn)行顆?；?，并在M9最小培養(yǎng)基中重新懸浮使成OD600=0.5。然后，用環(huán)丙沙星（10MIC）和氨基酸單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞4 h。每隔一段時(shí)間，取50 μL樣品，連續(xù)稀釋?zhuān)c(diǎn)涂于MHB瓊脂平板上，測(cè)定CFU/mL，計(jì)算存活細(xì)胞百分率。治療后，計(jì)算三種抗生素加胸腺嘧啶或不加胸腺嘧啶對(duì)大腸埃希菌CFU的減少。

2.2 核苷酸殺菌有效性的機(jī)制研究

第一，NAD+/NADH與細(xì)菌呼吸的測(cè)定。收集大腸埃希菌B2并在M9中稀釋成OD600=0.5。然后，加入不同濃度的環(huán)丙沙星（0、1、5和10倍MIC），加入或不加入胸腺嘧啶（10 mM）。培養(yǎng)4 h后，用0.01m PBS（pH=7.2）洗滌細(xì)胞顆粒，用200 μL預(yù)冷提取緩沖液重新懸浮[2]。裂解液在12 000 g，4 ℃條件下離心10 min，上清液用WST-8（中國(guó)北京）試劑盒檢測(cè)NAD+/NADH的比值。用INT還原法進(jìn)行監(jiān)測(cè)胸腺嘧啶對(duì)細(xì)菌的影響。大腸埃希菌B2在M9中被稀釋成OD600=0.5，并添加胸腺嘧啶（10 mM）。隨后，以1 mm INT和0.6 mm NADH為底物，在黑暗中孵育1 h，加入5%三氯乙酸可停止還原INT。不溶性甲醛在13 000 g下離心5 min，用

1 mL乙醇提取。上清液在485 nm處的吸光度在60 min內(nèi)測(cè)定。

第二，ATP水平和活性氧（ROS）的測(cè)定。在大腸埃希菌B2懸浮液中加入2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，10μM），在37 ℃條件下孵育30 min后，將

190 μL探針標(biāo)記的細(xì)菌細(xì)胞添加到96孔板中，并添加10 μL環(huán)丙沙星（0、1、5和10倍MIC），不添加或添加胸腺嘧啶

（10 mM）。37 ℃條件下孵育1 h后，立即使用M200無(wú)限酶標(biāo)儀測(cè)量熒光單位，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

2.3 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

第一，攻毒試驗(yàn)。首先對(duì)小鼠進(jìn)行免疫抑制處理，破壞它們的免疫系統(tǒng)[3]。然后對(duì)它們進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，使其感染病原菌。隨后，將小鼠分成3組，每組10只。

第二，小鼠感染的存活率檢測(cè)。對(duì)分成3組的小白鼠分別給藥，第一組小白鼠不給藥，腹腔注射生理鹽水；第二組小白鼠腹腔注射等劑量的藥物；最后一組小白鼠注射等劑量的藥物和核苷酸。數(shù)天之后，觀察小鼠的存活情況來(lái)判斷核苷酸能否增強(qiáng)殺菌抗生素的有效性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 最小抑菌濃度

五種藥物對(duì)大腸埃希菌ATCC25922和大腸埃希菌B2（含或不含胸腺嘧啶）的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）。

3.2 抗生素的殺菌活性

我們檢測(cè)了腸道沙門(mén)氏菌ATCC13076、鮑曼不動(dòng)桿菌19606和銅綠假單胞菌PA14三種常見(jiàn)的革蘭氏陰性病原體在聯(lián)合應(yīng)用抗生素氨芐西林、卡那霉素和抑菌抗生素四環(huán)素后的存活率，如圖1所示。

發(fā)現(xiàn)胸腺嘧啶增加了卡那霉素對(duì)多種病原體的活性，而氨芐西林和四環(huán)素沒(méi)有明顯的變化。這些數(shù)據(jù)表明胸腺嘧啶具有廣譜增強(qiáng)作用，與殺菌抗生素對(duì)多種病原體的作用與生長(zhǎng)期無(wú)關(guān)。

3.3 抗生素的殺菌機(jī)制

由于胸腺嘧啶不能降低殺菌抗生素的MIC值，但能增強(qiáng)抗生素的殺滅作用，因此推測(cè)胸腺嘧啶可能改變細(xì)菌的代謝，使耐藥菌對(duì)抗生素敏感。有幾項(xiàng)研究表明，TCA循環(huán)是致死抗生素的共同機(jī)制。因此，首先通過(guò)監(jiān)測(cè)NAD+/NADH比值來(lái)確定胸腺嘧啶對(duì)細(xì)菌TCA循環(huán)的影響。發(fā)現(xiàn)胸腺嘧啶（10 mM）的加入顯著降低了大腸埃希菌B2的比率（圖2A），表明胸腺嘧啶促進(jìn)了NAD+向NADH的轉(zhuǎn)化，從而加速了TCA循環(huán)?？紤]到NADH的產(chǎn)生有助于細(xì)菌的電子呼吸鏈，因此我們下一步評(píng)估胸腺嘧啶是否能提高細(xì)菌的呼吸。在30 min的監(jiān)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌B2表現(xiàn)出周呼吸率，而補(bǔ)充胸腺嘧啶顯著增強(qiáng)了細(xì)菌呼吸。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星和胸腺嘧啶的聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)使用環(huán)丙沙星更能改善細(xì)菌呼吸（圖2B）。此外，還測(cè)定了胸腺嘧啶處理后的細(xì)胞內(nèi)ATP水平。與呼吸增強(qiáng)一致，胸腺嘧啶顯著促進(jìn)了ATP的產(chǎn)生（圖2C）。這一結(jié)果表明了胸腺嘧啶與氨基糖苷類(lèi)抗生素的增強(qiáng)活性需要跨膜電化學(xué)梯度來(lái)穿透細(xì)胞。綜上所述，添加胸腺嘧啶可刺激細(xì)菌呼吸，并將耐受細(xì)胞轉(zhuǎn)化為代謝活性細(xì)胞。因此，活性細(xì)菌細(xì)胞對(duì)殺菌抗生素的殺滅更為敏感。

結(jié)語(yǔ)

通過(guò)研究大腸埃希菌B2對(duì)抗生素敏感性的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)外源代謝物加速了細(xì)菌的代謝，特別是呼吸，引發(fā)更多ROS的產(chǎn)生，從而提高了抗生素的療效。許多研究表明，細(xì)胞代謝狀態(tài)的改變可能在調(diào)節(jié)抗生素敏感性方面發(fā)揮作用。事實(shí)上，在基因上提高大腸埃希菌的基礎(chǔ)呼吸速率比在野生型細(xì)胞更能提高殺菌抗生素的效力。基因降低乙二醛酸循環(huán)也恢復(fù)了結(jié)核分枝桿菌、異煙肼、利福平和鏈霉素的敏感性。初步研究胸腺嘧啶增強(qiáng)環(huán)丙沙星對(duì)大腸埃希菌的殺滅作用機(jī)制時(shí)，首先看到了NAD+/NADH的降低和呼吸頻率的增加，說(shuō)明TCA循環(huán)加速了。這與外源丙氨酸和/或葡萄糖增強(qiáng)卡那霉素殺死遲鈍愛(ài)德華菌的機(jī)制一致，這也表明TCA循環(huán)是抗生素致死的共同機(jī)制。然后，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充胸腺嘧啶顯著增強(qiáng)了細(xì)菌呼吸。TCA和呼吸速率的加速意味著細(xì)菌代謝狀態(tài)的增加。然而，在抗生素的壓力下，細(xì)菌的能量代謝已經(jīng)失去平衡，因此能量的增加會(huì)加劇細(xì)胞死亡。人們普遍認(rèn)為，大腸埃希菌產(chǎn)生超氧化物的主要途徑是氧驅(qū)動(dòng)的呼吸電子傳遞鏈的氧化。我們發(fā)現(xiàn)，與環(huán)丙沙星單獨(dú)治療相比，聯(lián)合治療提高了活性氧（ROS）的產(chǎn)生。ROS的產(chǎn)生會(huì)損害細(xì)胞成分，包括DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。例如，L-絲氨酸增強(qiáng)了氧氟沙星和莫西沙星對(duì)大腸埃希菌的殺滅作用，增加了NADH的產(chǎn)生，破壞了鐵硫簇，從而刺激了內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生。同樣，ATP作為細(xì)胞呼吸的產(chǎn)物之一，在外源性胸腺嘧啶的作用下也會(huì)增加。這些結(jié)果與先前的觀察一致，即尿嘧啶的補(bǔ)充增加了AMP、CIP和GENT對(duì)大腸埃希菌的殺傷力，同時(shí)增加了呼吸速率和ATP的合成。綜上所述，胸腺嘧啶通過(guò)上調(diào)細(xì)菌代謝將耐受細(xì)菌轉(zhuǎn)化為敏感細(xì)菌。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳丹楓，周曉燕，李旭，章海風(fēng).響應(yīng)面法優(yōu)化冷鮮驢肉復(fù)合天然防腐劑配方[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（05）：244-252+227.

[2] 曹鵬，王東明，顧振華.川陳皮素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的化療增敏作用[J].中草藥，2009，40（09）：1418-1422.

[3] 王燕，魏永鴿，胡曉舟，等.10-羥基喜樹(shù)堿治療小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎[J].山東醫(yī)藥，2013，53（11）：29-31.