洛島紅雞卵黃囊源性間充質干細胞的分離培養及其分化潛能研究

摘 要： 旨在體外獲得并培養洛島紅雞卵黃囊間充質干細胞（chicken yolk sac mesenchymal stem cell，cYS-MSCs），檢測其體外增殖能力和生物學特性。本研究選取已孵化12天的健康洛島紅雞受精蛋的卵黃囊進行組織貼壁培養，選擇第5代cYS-MSCs進行免疫熒光和RT-PCR檢測表面標記基因；選擇第3代、第9代和第15代cYS-MSCs，每代次設置3個重復，繪制生長曲線、計算群體倍增時間和克隆形成率；通過核型分析檢測遺傳穩定性；選擇第9代cYS-MSCs進行成脂、成軟骨和成骨誘導，通過特異性染色和RT-PCR檢測多向分化能力。結果，分離培養的細胞為長梭形，呈漩渦狀或平行式生長；免疫熒光結果顯示CD29、CD73、CD90和CD166呈陽性表達，而造血干細胞標記基因CD34和泛白細胞標記基因CD45不表達；RT-PCR結果顯示CD29、CD44、CD73、CD90和CD166表達，而CD34和CD45不表達；cYS-MSCs呈“S”型增長，且第3代的群體倍增時間極顯著低于第9代（P＜0.001），第9代群體倍增時間極顯著低于第15代（P＜0.001），第3代的克隆形成率極顯著高于第9代（P＜0.001），第9代極顯著高于第15代（P＜0.001）；染色體核型分析結果顯示經過連續傳代的cYS-MSCs染色體數量、形態正常（2n=78，zz）；誘導分化的cYS-MSCs，特異性染色和RT-PCR結果顯示cYS-MSCs可被成功誘導分化為成脂肪細胞、成軟骨細胞和成骨細胞。綜上，本研究成功從雞胚卵黃囊中分離獲得MSCs，且能在體外培養增殖，并且分離的cYS-MSCs具有MSCs的生物學特性和多向分化潛能，其多向分化潛能預示細胞移植的前景，可為洛島紅雞種質資源保存提供依據和潛在可利用資源。

關鍵詞： 卵黃囊；間充質干細胞；洛島紅雞；生物學特性；分化潛能

中圖分類號：

S831.3"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1252-12

收稿日期：2024-06-26

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD1300100；2021YFD1200303）

作者簡介：閆 炎（1998-），女，山東濟寧人，碩士生，主要從事間充質干細胞與動物生物技術研究，E-mail：17853651215@163.com;劉晏辰（1997-），男，黑龍江佳木斯人，博士生，主要從事畜牧相關研究，E-mail：401979899@qq.com。閆炎和劉晏辰為同等貢獻作者

*通信作者：姜運良，主要從事動物分子遺傳育種與生物技術研究，E-mail：zhaojy@sdau.edu.cn; 關偉軍，主要從事畜禽遺傳資源保存與應用研究，E-mail：guanweijun@caas.cn

Isolation， Culture and Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells of Yolk

Sacs from Rhode Island Red Chicken

YAN" Yan "LIU Yanchen2， WANG Zhongfa2， LI Minjuan2， HE Yunan2， GUAN" Weijun^2*， JIANG" Yunliang^1*

（1.College of Animal Science and Technology， Shandong Agricultural University，

Taian 271000，" China;

2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract： The study aimed to obtain and cultivate Rhode Island Red yolk sac mesenchymal stem cells （cYS-MSCs）， then evaluate proliferative capacity and biological properties in vitro. The yolk sac of fertilized Rhode Island Red eggs， which had been incubated for 12 days， was selected for tissue adherent culture. The 5th generation of cYS-MSCs was chosen for immunofluorescence and RT-PCR analyses to detect surface marker genes. Additionally， the 3rd， 9th， and 15th generations of cYS-MSCs were selected， with 3 replicates established for each generation， to plot growth curves， calculate population doubling time， and assess colony formation rates. Genetic stability was evaluated through karyotyping. The 9th generation of cYS-MSCs was further selected for adipogenic and cartilage induction， with multidirectional differentiation capabilities assessed using specific staining and RT-PCR. The isolated cells were characterized by a long， spindle-shaped morphology， growing in either a swirling or parallel pattern. Immunofluorescence results indicated the expression of CD29， CD73， CD90， and CD166， while the hematopoietic stem cell marker gene CD34 and the panleukocyte marker gene CD45 were not expressed. Additionally， RT-PCR results confirmed the expression of CD29， CD44， CD73， CD90， and CD166， with CD34 and CD45 remaining unexpressed. The cYS-MSCs exhibited an ′S′ type growth pattern， with the population doubling time of the 3rd generation being extremely significantly lower than that of the 9th generation （Plt;0.001）. Furthermore， the population doubling time of the 9th generation was extremely significantly lower than the 15th generation （Plt;0.001）. The cloning rate of the 3rd generation was extremely significantly higher than the 9th generation （Plt;0.001）， and the cloning rate of 9th generation was also extremely significantly higher than the 15th generation （Plt;0.001）. Karyotype analysis revealed that the number and morphology of cYS-MSCs were normal （2n=78， zz）. Specific staining and RT-PCR results demonstrated that cYS-MSCs could be successfully induced to differentiate into adipoblasts， chondroblasts， and osteoblasts. In conclusion， MSCs were successfully isolated from the yolk sac of chicken embryos， demonstrating the ability to be cultured and proliferated in vitro. The isolated cYS-MSCs exhibited the biological characteristics and multidirectional differentiation potential typical of MSCs. This differentiation potential suggests promising prospects for cell transplantation， providing a foundation and potential resources for the conservation of Rhode Island Red germplasm resources.

Keywords： yolk sacs; mesenchymal stem cells; Rhode Island Red chicken; biological characteristics; differentiation potential

*Corresponding authors： JIANG Yunliang，E-mail： zhaojy@sdau.edu.cn; GUAN Weijun，E-mail：guanweijun@caas.cn

洛島紅雞育成于美國洛德島州，屬于兼用型雞種，羽毛呈深紅色，尾羽黑色，具有體軀各部肌肉發達，體質強健，適應性強等優勢，洛島紅雞母雞的性成熟期約180 d，年產量為160～170個，高產者可達200個，現代禽業多用其作為父本與其他兼用型雞或白來航雞雜交，育成高產的褐殼蛋商品雞，因此洛島紅雞是禽業重要品種之一。我國擁有世界最大的畜禽種業市場，切實加強畜禽種質資源保護，對于提高我國核心種源自給率、提升畜禽育種自主創新能力等方面意義重大。

卵黃囊（yolk sac， YS）是一種胚胎外組織，從大約第2胚齡開始從胚胎腸道逐漸包裹蛋黃，YS形成3層細胞有序排列，剛開始胚胎的外胚層細胞迅速擴散到蛋黃表面，內胚層細胞在蛋黃和外胚層細胞之間擴散，形成與蛋黃接觸的上皮細胞層，對于吸收營養有重要作用^［1］，隨著卵黃被吸收，YS于孵化第20天全消失。YS是一種多功能器官， 發揮宿主免疫、營養攝取、碳水化合物和脂類代謝以及紅細胞生成等功能，因此YS是雞發育中胚胎生長、發育和健康的很重要器官^［2］。盡管卵生物種和胎生物種存在較大區別，但在胚胎發育和成熟時，YS發揮了多種相似功能。有研究使用RNA-seq比較了雞、人類和小鼠的YS，發現鳥類和哺乳動物的發育不同，但兩者YS的功能保守^［3-4］。雞YS是母體將營養輸送到胚胎的重要裝置，遠早于胎盤發揮作用的時間^［5］。有報道關于靈長類動物胚胎發育期間強調了YS作為造血、生殖細胞發育和營養供應的關鍵作用^［6］。同時有大量關于臍帶MSCs的相關報道，甚至已經涉足臨床醫學領域^［7-9］。鑒于在鳥類胚胎發育中卵黃囊起到與哺乳動物臍帶相似的作用，即輸送營養、造血等功能，猜測鳥類胚胎發育時卵黃囊中有MSCs存在的可能。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是存在于大多數組織中的多能細胞，如骨髓、胎盤、脂肪、肌肉、羊水、肝、肺、脾、臍帶、牙髓、華頓氏膠質、真皮和軟骨膜等，MSCs最初被發現具有自我更新和多向誘導分化潛能（脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌腱和肌肉）^［10-13］。據報道間質干細胞樣細胞可被誘導為內皮細胞、干細胞和神經細胞^［14-18］。MSCs在生命科學的細胞修復、發育生物學、藥學等多領域有極為廣闊的應用前景，目前研究最深入的MSCs來源于人骨髓，且多種來源的MSCs的使用已經成為多種疾病有前途的療法^［19］。研究表明，通過細胞療法能使受損組織募集足夠的MSCs，以減輕炎癥、增強血管生成和促進再生，靜脈注射的MSCs遷移到多種器官，有報道稱間充質干細胞自主遷移到損傷或炎癥組織^［20-22］。在機制上，成纖維細胞和內皮細胞可能是損傷修復過程中最常見的細胞類型，但有研究表明來自骨髓的MSCs可以遷移到受損組織部位并釋放多種生長因子，如成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）和血管內皮生長因子（VEGF）等，都影響成纖維細胞和內皮細胞的發育，猜測這是MSCs促進各種損傷修復的機制^［23-25］。不同組織來源的MSCs作為種質資源細胞，可為其品種進行種質資源保存、科學研究及臨床疾病治療提供物質基礎。

前人對MSCs的研究大多集中于哺乳動物，對于禽類來源的MSCs研究相對較少，與哺乳動物相比，雞蛋來源豐富，容易采集，即雞胚胎可廣泛獲得，成本較低，故cYS-MSCs具有多種優勢，可以輕易在體外分離、培養和增殖^［26-28］。本研究對洛島紅雞雞胚的卵黃囊進行MSCs的分離培養及分化潛能研究，可降低MSCs的研究成本，試圖為研究家禽來源的MSCs提供了更多的組織來源，同時MSCs的多向分化潛能預示細胞移植的前景，可為家禽種質資源保存提供依據和潛在可利用資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

洛島紅雞受精蛋由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所昌平試驗基地提供。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白酶（Trypsin，Gibco），胎牛血清（FBS，Gibco），Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F12（DMEM/F12，Gibco），青霉素-鏈霉素混合溶液（Gibco），Ⅳ型膠原酶（Sigma），山羊血清（Bioss），CD29、CD73、CD90、CD166、CD34、CD45一抗（Abcam），FITC標記山羊抗兔二抗（Bioss），RNA逆轉錄試劑盒（TaKaRa），2×Fast Pfu PCR Master Mix試劑盒（Servicebio），50×TAE（Biotopped），瓊脂糖（BIOWEST），Gimesa染液（Solarbio），油紅O染色試劑盒（Solarbio），阿利新藍染色試劑盒（Solarbio），茜素紅S染色液（Solarbio）。

1.1.3 主要儀器

激光共聚焦顯微鏡（Nikon），TCS SP8激光共聚焦顯微系統（Leica），DMI6000B熒光微分干涉倒置顯微鏡（Leica），TH4-100倒置顯微鏡（Olympus），CO2培養箱（Heraeus），D1008小型離心機（DLAB），高速冷凍離心機（可成儀器），紫外分光光度計（Bio Drop），電泳儀（北京六一儀器廠），Veriti梯度PCR儀（Applied Biosystems），Gel Doc XR＋凝膠成像系統（Bio-Rad）。

1.2 試驗方法

1.2.1 cYS-MSCs的分離培養" 將洛島紅雞受精蛋置于孵化箱中，設置38 ℃、50%濕度、5% CO2孵化。取出12胚齡受精蛋，用新潔爾滅浸泡、清洗，再用75%酒精擦拭，在無菌條件下輕敲開胚蛋，用組織剪分離并剪下卵黃囊，剝離血管，用含1%青霉素-鏈霉素混合溶液的PBS清洗3遍，再將其剪成體積為1 mm3大小的組織塊，PBS清洗后用細胞夾將組織塊轉移至60 mm培養皿中，待組織塊適度干燥并附著于培養皿底時用DMEM/F12添加10% FBS、1%青霉素-鏈霉素混合溶液置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。3 d更換培養基，5 d左右可在顯微鏡下觀察到有大量細胞從組織周圍爬出，待細胞匯合度達到80%時傳代，傳代后的細胞為長梭形，呈平行式或漩渦式排列，是典型的成纖維樣細胞，具有間充質干細胞表型，第3代即可獲得較高純度的cYS-MSCs，繼續傳代，進行后續試驗。

1.2.2 cYS-MSCs的體外增殖能力檢測" 選擇第3代、第9代和第15代cYS-MSCs進行細胞計數，24孔板鋪板，每孔接種1×104個細胞，置于細胞培養箱中培養，每隔24 h計數1次，每次選取3個孔，每孔分別加入500 μL 0.25%胰蛋白酶消化后，再加入500 μL培養基終止，制成1 mL細胞懸液后進行計數，計算出平均細胞數，連續計數7 d。根據每天平均值細胞數繪制生長曲線，根據公式（1）計算3個代次細胞的群體倍增時間（population doubling time，PDT）：

PDT=（t-t0） lg2/（lgNt-lgN0） （1）

式（1）中，t0為培養起始時間，t為培養終止時間，N0為培養起始細胞數，Nt為培養終止細胞數。

1.2.3 cYS-MSCs的克隆形成能力檢測" 選擇第3代、第9代和第15代的cYS-MSCs，選用6孔板鋪板，每孔接種100個細胞，每個代次分別鋪3個孔，置于細胞培養箱中培養，4 d換一次液，14 d后觀察到單個cYS-MSCs形成較大細胞克隆團，吸出原培養基，用PBS清洗后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，吸出多聚甲醛，用PBS洗3遍以去除殘留多聚甲醛，再加入1 mL Gimesa工作液（Gimesa母液：Gimesa稀釋液=1∶9）染色25 min，用PBS洗3遍，加入1 mL PBS，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞克隆團形態，拍照并計數克隆團數量，計算3個代次cYS-MSCs克隆形成率的平均值：

克隆形成率（％）=克隆形成數/接種細胞數×100（2）

1.2.4 染色體核型分析

選擇細胞匯合度大于95%的cYS-MSCs，用0.25%胰蛋白酶消化，1 200 r·min^-1離心3 min，用1 mL 10%FBS的DMEM/F12完全培養基重懸細胞，將細胞懸液加入含2 mL 10% FBS的DMEM/F12完全培養基的培養皿中，放入細胞培養箱中培養，20 min后可在顯微鏡下觀察到大部分細胞圓而發亮，附著于培養皿底，此時添加秋水仙素10 μg·mL^-1，繼續放入細胞培養箱中培養24 h。用0.25%胰蛋白酶消化收集于15 mL離心管，1 200 r·min^-1離心8 min，用0.075 mol·L^-1氯化鉀溶液重懸細胞，37 ℃水浴，低滲處理30 min后加入1 mL固定液（冰醋酸：甲醇=1∶3），輕吹混勻。1 200 r·min^-1離心8 min，棄上清后加入5 mL固定液，輕吹混勻后室溫靜置30 min，重復1次，最后加入1 mL固定液重懸細胞，用一次性塑料滴管吸取細胞懸液在預冷的載玻片1.5 m上方均勻滴下，室溫干燥后，浸入含Gimesa工作液的染缸中染色25 min。水滴清洗多余染液，室溫風干，置于顯微鏡下觀察染色體形態并拍照。

1.2.5 免疫熒光表型分析

將第5代細胞接種于6孔板中，在顯微鏡下觀察細胞匯合度達到70%時，PBS清洗細胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗，0.1% TritonX-100通透5 min，PBS清洗，山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗3遍，一抗CD29、CD44、CD90、CD166、CD34和CD45，4 ℃孵育過夜，PBS清洗后，FITC標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，最后采用DAPI進行核染15 min，在倒置熒光顯微鏡下采用EZC1fFreeViewer軟件進行可視化觀察并拍照。

1.2.6 RT-PCR檢測標記基因

收集第5代細胞，用Trizol提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定RNA的質量和濃度，使用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）逆轉錄1 μg總RNA，反應體系及程序按照制造商的說明書執行。使用2×Fast Pfu PCR Master Mix試劑盒于梯度PCR儀中進行聚合酶鏈式反應（RT-PCR），PCR反應體系（20 μL）含有2×Fast Pfu PCR Master Mix 10 μL，0.8 μL cDNA，0.8 μL引物和8.4 μL ddH2O，反應程序按照試劑說明書進行。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠，PCR產物在130 V，300 mA條件下電泳30 min，在瓊脂糖凝膠成像儀中進行可視化分析。用于RT-PCR的GAPDH、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166、CD34、CD45、LPL、PPAR-γ、ACAN、SOX9、osteopontin （OPN）和collagen type Ⅰ（COLⅠ）引物見表1。

1.2.7 cYS-MSCs多向分化能力鑒定" 在DMEM/F12中添加1.0 μmol·L^-1地塞米松、0.5 mmol·L^-1 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、9 mg·L^-1胰島素（INS）、180 μmol·L^-1吲哚美辛、10% FBS對cYS-MSCs進行成脂誘導分化，cYS-MSCs接種于6孔板，當長至100%匯合時，用成脂分化培養基替代完全培養基，3 d換1次液。在顯微鏡下觀察到cYS-MSCs出現脂滴時，使用油紅O試劑盒進行染色，并對誘導后cYS-MSCs進行RT-PCR檢測成脂特異性基因脂蛋白脂肪酶（LPL）和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）的表達情況。在DMEM/F12中添加50 mg·L^-1 L-脯氨酸、0.1 μmol·L^-1地塞米松、0.5 mol·L^-1丙酮酸 鈉、50 μg·L^-1 L-抗壞血酸、10 ng·L^-1 TGF-β3、10 μg·L^-1 TGF-1、10% FBS、1% ITS、1%青霉素-鏈霉素混合溶液對cYS-MSCs進行成軟骨分化誘導，當cYS-MSCs達到70%匯合時，用成軟骨誘導培養基替換完全培養基，3 d換1次液，在顯微鏡下觀察直至cYS-MSCs出現軟骨結節時，用阿利新蘭試劑盒染色，并對誘導后cYS-MSCs進行RT-PCR檢測成軟骨特異性基因聚蛋白聚糖（ACAN）和性別決定區Y框蛋白9（SOX9）的表達情況。在DMEM/F12中添加0.1 μmol·L^-1地塞米松、10 nmol·L^-1 β-甘油磷酸鈉、50 mg·L^-1 L-抗壞血酸、15% FBS、1%青霉素-鏈霉素混合溶液對cYS-MSCs進行成骨分化誘導，當cYS-MSCs達到70%匯合時，用成骨誘導培養基替換完全培養基，3 d換1次液，在顯微鏡下觀察到鈣沉積或鈣結節，用茜素紅染液進行染色，并對誘導后cYS-MSCs進行RT-PCR檢測成骨特異性基因骨橋蛋白（OPN）和Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）的表達情況。

1.3 數據處理

本研究對cYS-MSCs的生長曲線、群體倍增時間以及克隆形成率進行統計學分析，采用SPSS進行單因素方差分析檢測組內和組間差異的顯著性，數據以“均數±標準差（mean±SD）”表示，用Graphpad Prism 7軟件對統計圖進行分析。Plt;0.001表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 cYS-MSCs的分離培養

采用組織貼壁法獲得細胞，3 d后細胞從組織塊周圍爬出，此時可能有多種細胞混合生長，換液后繼續培養，當細胞匯合度達70%～80%進行傳代，由于cYS-MSCs的塑料粘附力弱于其他貼壁細胞，通過控制胰蛋白酶的作用時間，對cYS-MSCs進行純化。第3代細胞基本純化，均為長梭形，且呈漩渦狀或平行式生長。cYS-MSCs傳至第18代時，出現增殖減慢、空泡和黑色物質等衰老跡象（圖1）。

2.2 熒光抗體檢測細胞表面抗原

為了確定目前培養的卵黃囊源性的新型細胞表型，通過免疫熒光檢測到間充質干細胞的表面標志物CD29、CD73、CD90和CD166呈陽性表達，而造血祖細胞標志物CD34和泛白細胞標志物CD45不表達，呈陰性（圖2）。

2.3 RT-PCR檢測細胞表面標記基因

選擇純化后的第5代細胞進行RT-PCR，結果顯示CD29、CD44、CD73、CD90和CD166均表達，而CD34和CD45不表達（圖3），由此確定體外分離獲得的細胞符合國際MSCs表型。

2.4 cYS-MSCs的體外增殖能力檢測

通過不同代次的生長曲線評估cYS-MSCs的增殖能力（圖4A）。第3代的增殖的能力極顯著高于第9代（P＜0.001）；第9代的增殖能力極顯著高于第15代的增殖能力（P＜0.001），大多數的cYS-"" MSCs在傳代第2天后從潛伏期進入對數生長期，3個代次的cYS-MSCs均呈“S”型增長，包括潛伏期、對數生長期和平臺期3個時期（圖4A）。根據PDT計算公式可得第3代、第9代和第15代的PDT分別為39.78、40.72和45.02 h（圖4B）。

2.5 cYS-MSCs的克隆形成能力檢測

cYS-MSCs中單個細胞接種培養后，24 h部分細胞貼壁，貼壁細胞呈長梭形，10 d后觀察到cYS-MSCs呈放射狀向周圍擴增，用Gimesa染色分析3個代次cYS-MSCs的集落形成情況。結果顯示，第3代、第9代和第15代的cYS-MSCs均有單細胞克隆團形成，第3代cYS-MSCs的增殖能力極顯著高于第9代cYS-MSCs（P＜0.001），第9代cYS-MSCs的增殖能力極顯著高于第15代（P＜0.001）（圖5A）。根據克隆形成率計算出3個代次的克隆形成率分別為（42.67±3.79）%、（38.33±1.43）%和（19.00±2.48）%，結果表明隨著代次的增加cYS-MSCs的增殖能力逐漸減弱（圖5D）。

2.6 cYS-MSCs核型分析

為了檢驗cYS-MSCs在傳代過程中是否會發生變異，對第3代和第15代的cYS-MSCs進行了細胞遺傳學分析。母雞染色體核型為2 n=78，zw，公雞染色體核型為zz。第18代cYS-MSCs核型分析結果顯示，其染色體數目為2 n=78，包括一對性染色體zz，其中1～12號染色體著絲點相對容易分析，13～39號染色體均為粒狀，染色體未見異常，表明多次傳代后cYS-MSCs的染色體形態和數目維持正常，未發生變異等情況（圖6）。

2.7 cYS-MSCs多向分化能力鑒定

2.7.1 成脂誘導分化

cYS-MSCs在成脂分化培養基中培養，在顯微鏡下觀察，直到7 d后cYS-MSCs出現大量脂滴積累，呈具有強折光性的珠狀（圖7B），對形成脂滴的cYS-MSCs進行油紅O染色，顯微鏡下觀察，可見細胞間脂滴被染為橙紅色（圖7C）。進一步對誘導成功的cYS-MSCs進行RT-PCR，結果顯示誘導分化后的cYS-MSCs表達LPL和PPAR-γ（圖7D），表明cYS-MSCs可經過體外誘導分化為脂肪細胞。

2.7.2 成軟骨誘導分化

cYS-MSCs在成軟骨分化培養基中培養14 d后用阿利新藍試劑盒染色，顯微鏡下觀察誘導后的軟骨細胞呈藍色（圖8C），此外，RT-PCR結果顯示，成軟骨誘導分化后的cYS-MSCs表達ACAN和SOX9（圖8D），表明cYS-MSCs可在體外被誘導分化軟骨細胞。

2.7.3 成骨誘導分化

為了評估cYS-MSCs在體外向成骨細胞的分化潛能，其在成骨分化培養基中培養14 d后，在顯微鏡下觀察到多個明顯的礦化結節（圖9B），用茜素紅染液染色后，礦化結節呈紅"" 色（圖9C）。進一步的RT-PCR結果顯示，成骨誘導分化后的cYS-MSCs表達OPN和COL Ⅰ（圖9D）。這些結果表明cYS-MSCs具有分化為成骨細胞的潛能。

3 討 論

國際間充質和組織干細胞委員會提出定義MSCs的最低標準：第一，MSCs必須具有可塑性；第二，MSCs必須表達CD73和CD90，不表達CD45、CD34或CD14等；第三，必須在體外能誘導分化為成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞^［29-30］。cYS-MSCs分化為成脂、成軟骨和成骨細胞需要加入特定的分化誘導液。含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、地塞米松和吲哚美辛的成脂分化誘導液具有將cYS-MSCs誘導為成脂細胞的能力，PPAR-γ是一種脂肪特異性轉錄因子，LPL是一種脂質交換酶，主要參與脂類的合成和儲存，在本研究中PPAR-γ和LPL的表達水平在脂肪分化早期上調，進一步證實了cYS-MSCs的成脂分化能力。油紅O是一種脂溶性偶氮染料，是很強的脂溶性試劑和脂肪染色劑，能特異性地使細胞或組織內甘油三脂等中性脂質等染色，細胞浸入油紅O染色液時，油紅O溶于細胞內脂滴中，使其呈紅色或橙紅色。成軟骨細胞形成分化能力由阿利新蘭染色和標記基因ACAN、SOX9來評估，SOX9是軟骨形成的早期標志，是軟骨細胞特異性基因ECM的激活劑以及軟骨的主要結構成分，cYS-MSCs在含有TGF-β3的軟骨分化誘導液中培養，首先收回突起，聚集成團，團中間的細胞再經過分裂分化形成大而圓的成軟骨細胞，通過阿利新蘭染色，成軟骨細胞被染成藍色，后續的RT-PCR顯示誘導后的cYS-MSCs表達ACAN和SOX9，說明其具有分化為成軟骨細胞的能力。有研究建立了人類骨髓間充質干細胞成骨分化系統，將第2代或第2代的MSCs在含有地塞米松、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉的培養基中培養，雖然較高的初始接種密度不影響APase活性的細胞數量，但培養物中沉積了明顯更多的礦物質，從而也暗示了經歷成骨細胞譜系進展的MSCs合成自分泌或旁分泌因子的作用^［31］，在本研究中，cYS-MSCs的成骨分化誘導過程中細胞迅速增殖。隨著誘導時間的延長，細胞逐漸出現礦鹽沉積，最終形成礦化結節，并表現出高遮光性。通過茜素紅S染色，礦化結節被染為橙紅色，說明cYS-MSCs具有分化為成骨細胞的潛力，可能適合骨再生醫學的應用。本研究致力于對cYS-MSCs的成脂、成軟骨和成骨的多向分化能力鑒定，區別于前人對于cYS-MSCs的神細胞經分化研究^［32］。此外，cYS-MSCs在經過傳代培養后逐漸純化，cYS-MSCs呈長梭形，并以漩渦狀生長，符合MSCs表型，染色體隨著傳代次數的增加并未發生變異，與研究較成熟的骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、脂肪間充質干細胞等特性相似，與其他品種如白來航雞、羅曼鶴雞骨髓間充質干細胞特性相似^［33-34］。且MSCs低表達HLA-Ⅰ型抗原，不表達HLA-Ⅱ型抗原，具有免疫逃逸的能力，與其他干細胞相比，無醫學倫理爭議。

雞胚YS由內胚層細胞組成，6胚齡后包圍整個卵黃，由卵黃囊蒂與雞胚連接，使營養物質通過膜上血管不斷吸入雞胚，隨著卵黃被吸收，YS在12～13胚齡之后易破，20日胚齡完全消失。YS具有重要的功能，包括產生和運輸胚胎所需的蛋白質，參與代謝物質交換，促進維生素，氨基酸和免疫球蛋白的轉移；參與第一批血細胞的形成等^［35-37］。有研究表明YS是MSCs的來源之一，cYS-MSCs已經從人體中分離出來，這些細胞具有成纖維細胞樣形態，就其在中胚層的分化潛力而言，可以分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞^［38-39］。有研究采用酶消化法分離出雞胚cYS-MSCs，并成功進行了神經誘導分化，證明了cYS-MSCs的可塑性及其在神經細胞治療中的潛能^［40］。相比于其他研究，本研究采用組織貼壁法分離cYS-MSCs，相對于胰蛋白酶消化法，此方法操作簡單、步驟少，試驗處理時間短，不使用胰蛋白酶或膠原酶，分離成本較低；按照國際MSCs鑒定標準進行成脂、成軟骨、成骨誘導來檢測cYS-MSCs多向誘導分化能力。雞胚成本低，來源廣泛，是經典生物學熱門模型，成功分離洛島紅雞雞胚的cYS-MSCs作為種質資源細胞，可為洛島紅雞進行種質資源保存、科學研究及臨床疾病治療提供物質基礎。

4 結 論

本研究成功獲得了洛島紅雞雞胚cYS-MSCs，并在體外培養傳代，表現與其他MSCs相似的特性，具有強大的自我更新和復制能力，表達MSCs表面標記基因CD29、CD44、CD73、CD90和CD166，不表達造血祖細胞標志物CD34和泛白細胞標志物CD45，可以向成脂、成軟骨、成骨細胞分化，具有多向分化潛能。cYS-MSCs通過分泌細胞因子和生長因子，促進受損組織的愈合和再生，為禽類的創傷愈合和組織再生提供新的治療手段；可以用于建立疾病模型，以研究多種疾病的發病機制和治療方法；還可用于組織工程和細胞治療，在再生醫學或細胞移植方面有一定的潛能。cYS-MSCs可以用于保存洛島紅雞的遺傳資源，通過細胞培養和克隆技術可以將具有重要經濟和生態價值的基因組信息保存下來，為未來的育種提供基礎；通過對cYS-MSCs的研究，可以建立基于間充質干細胞的基因庫，這種基因庫不僅可以用于保護遺傳多樣性，還可以為基因工程和轉基因技術的應用提供支持；可以與輔助繁殖技術相結合，這對于遺傳資源的保護和繁育具有重要意義。但對于cYS-MSCs的機制和實際應用還需進行更深入的研究。

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（編輯 郭云雁）