忍冬Flowering Locus T基因家族鑒定及在開花進程中的表達分析

摘要：為研究植物開花整合基因FT（Flowering Locus r）及其同源基因在忍冬（Lonicera japonica Thunb.）開花過程中的表達模式及功能，本研究通過生物信息學方法，利用忍冬品種“華金6號”基因組信息，篩選獲得7個LjFT及其同源基因，并對其進行了系統分析。利用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析LjFT及其同源基因的表達情況，發現LjFT基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸上升，表明其可能是忍冬開花的促進子；LjFTL2、LjFTL3、LjFTL4、LjFTL5和LjFTL6基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸下降，表明其可能是忍冬開花的抑制子。進一步利用異源表達擬南芥的方法對LjFT進行功能分析發現，與對照相比，LjFT過表達的擬南芥植株開花時間提前，說明LjFT具有促進植物提早開花的功能。本研究結果為解析忍冬開花時間的調控機制提供了重要線索，同時為不同花期忍冬新品種的選育提供了基因靶點。

關鍵詞：忍冬；FT及其同源基因：開花；表達分析；功能分析

中圖分類號：S567.79：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0010-09

忍冬（Lonicera japonica Thunb.）是忍冬科忍冬屬多年生纏繞藤本植物，在中國各地均有分布，有兩千多年的栽培歷史。金銀花為忍冬的干燥花蕾或初開的花，主產于河南、河北和山東，具有疏散風熱、清熱解毒的功效，以及抗菌、抗炎、抗病毒等多種藥理作用。

忍冬從幼蕾到花開放大體可以分為幼蕾、三青、二白、大白、銀花、金花、凋花七個階段，以花發育早期收獲的金銀花藥效成分含量較高，即以大白、二白和三青階段的金銀花藥材為佳，銀花、金花次之。其中大白期是每茬金銀花花蕾采收的最佳時期，如果采摘過早，金銀花花蕾幼小，會導致產量降低：如果采摘過晚，則花已開放，藥效降低。因此，適時采摘是提高金銀花產量和質量的關鍵。但是忍冬常見品種的花期集中，只有6-8天，若遇到高溫年份，花期還會更短，需要雇傭勞動力采摘，而采摘期多在春耕大忙期，這不僅會導致人工成本增加，還會導致采摘的金銀花質量難把控或出現因采摘不及時而導致花蕾開放的情況，降低經濟效益。因此，選育不同花期的忍冬品種是金銀花種植業亟待解決的重要問題之一。研究表明植物的花期主要受開花時間基因調控網絡的控制，然而目前有關忍冬開花時間基因調控網絡及關鍵調控因子的研究較少，忍冬開花時間的調控機制尚不明確。

開花是植物從營養生長向生殖生長轉變的過程，開花相關基因的表達是實現這一轉變的基礎，環境因子以及細胞自身的生長狀況對這些基因的表達起著調控作用。根據對模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，一般認為，植物的開花時間調控網絡由光周期途徑、春化途徑、自主途徑、溫度途徑、年齡途徑和赤霉素途徑組成。植物生長到一定的階段，經過春化作用、光周期誘導等，在FLC（FLOWERING /O-CUS C）、CO（CONSTANS）、LFY（LEALY）、FT（FLOWERING LOCUS T）和AP1 （APETALA1）等多個基因的協同作用下誘導花芽的分化，最終形成花器官。在這個過程中，6條開花通路調節信號傳遞到開花整合基因FT，FT基因編碼的蛋白產物是可以長距離轉運的成花素，其通過整合復雜的調控信號傳遞到花分生組織，進而控制植物開花。因此，成花素基因FT是植物開花調控途徑中的匯集點，是決定植物開花時間的關鍵基因。目前，在許多植物中發現了FT及其家族成員的存在，如小麥（Triticum aestivum L．）的TaVRN3（Vernalization 3）、玉米（Zea mays L.）的ZmZCN8（ZEA CENTRORADIALIS 8）、大豆[Gly-czne max （L.） Merr.]的GmFT2a（Glyma.16G150700）和GmFT5a（Glyma. 16G044100）。及GmFT2b（Glyma. 16G151000）、園藝作物菊花[Chrysanthemum morifolium（Ramat.）Tzvel.]的CmFTL3（CmFT-Iikes3）等。FT及其同源基因在長、短日照和中性日照植物中廣泛存在，可能具有相似的功能，這為不同物種的開花時間調控研究提供了思路。

金銀花是我國傳統大宗中藥材，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品以及養殖等領域。不同花期的忍冬品種是金銀花種植產業中的重大需求。然而，目前忍冬FT及其同源基因尚未得到鑒定，基因功能尚不明確，阻礙了不同花期忍冬新品種的選育。因此，開展忍冬FT及其同源基因的克隆鑒定、表達分析及功能研究，可為解析忍冬開花時間的調控機制提供重要線索，同時為不同花期忍冬新品種的選育提供基因靶點。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于基因表達分析及基因克隆的植物材料取自山東中醫藥大學藥用植物園的忍冬植株，品種為“華金六號”。基因轉化所用的擬南芥為Col-O生態型。

1.2 忍冬FT及其同源基因的鑒定及理化性質分析

利用“華金6號”忍冬基因組測序信息，通過基因注釋、Blast、PCR克隆等方法，篩選獲得7個LjFT及其同源基因。使用ExPASy server（ht-tps：//web. expasy.org/protparam/）在線網站預測LjFT及其同源蛋白的理化性質，包括蛋白長度（protein length）、蛋白分子量（protein molecularweight，MW）、理論等電點（theoretical isoelectricpoint，pl）、不穩定指數（instability index）和親水性：平均值（grand average of hydropathicity，GRA-VY）。使用Plant PLoc （http：//www. csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant/#）在線網站預測LjFT及其同源蛋白亞細胞定位。

1.3 忍冬FT基因家族系統發育

從TAIR數據庫（http：//www. arabidopsis.org/）下載擬南芥FT及其同源蛋白序列，使用DNAMAN軟件對忍冬和擬南芥FT及其同源蛋白序列進行同源性比對。使用MEGA x軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）對忍冬、擬南芥、玉米、大豆、毛果楊FT及其同源蛋白序列構建進化樹，Bootstrap值設置為1 000。

1.4 忍冬FT及其同源基因的基因結構及保守基序

使用Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds. gao-lab. org/）在線網站分析基因結構。使用Multiple EM for Motif Elicitation（MEME，https：//meme-suite. org/meme/）在線網站分析motif識別的motif總數限制為10個。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

總RNA提取用試劑盒FastPure Plant TotalRNA Isolation Kit（Vazyme，南京），用超微量分光光度計檢測RNA濃度，用l070瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度。利用反轉錄試劑盒Primer-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKa-Ra，大連）合成cDNA第一鏈，于-20℃保存備用。

1.6 LjFT及其同源基因表達分析

選取種植于山東中醫藥大學藥用植物園的生長狀態一致的“華金6號”忍冬扦插苗（5月份開花）和一年生實生苗（當年不開花）進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析，分別于2023年3月15日、4月14日、5月4日取葉片材料，設3個生物學重復，用于基因表達檢測：所有樣品材料均在上午10時左右采集，每次取5-8片葉，采后立即放入液氮中冷凍保存。RT-qPCR引物（表1）采用Primer Premier 5根據LiFT及其同源基因的CDS設計，Actin作為內參基因，采用TB GreenPremix Ex TaqⅡ（TaKaRa，大連）和CFX96 Real-Time System（BIO-RAD，USA）進行RT-qPCR分析。利用2-ΔΔCt方法計算LjFT及其同源基因的相對表達量，每個樣品進行3次重復。

1.7 LjFT過表達載體的構建與遺傳轉化

利用PCR方法克隆得到LjFT基因的CDS序列，將pGFPGUSplus質粒用Xba I和Sac I進行雙酶切，切膠回收大片段，將LjFT基因的CDS序列利用同源重組方法連接到pGFPGUSplus載體，獲得pGFPGUSplus-/jFT重組過表達載體；將構建好的過表達載體轉入農桿菌GV3101，活化培養獲得侵染液；選取長勢良好的擬南芥植株，剪除角果及開放的花，利用花序侵染法侵染未開放的花，保濕培養1天，約1個月后收獲成熟的種子：收獲的擬南芥種子用75%乙醇消毒后撒在含有潮霉素的1/2 MS固體培養基上，篩選陽性植株。以AtTUB2作為內參基因，采用TB Green Premix ExTaqⅡ（TaKaRa，大連）和CFX96 Real-Time Sys-tem（BIO-RAD，USA）進行RT-qPCR分析。利用2-ΔΔCt方法計算對照及過表達植株中LjFT的相對表達量。經鑒定具有潮霉素抗性且LjFT超量表達的擬南芥株系，收獲其種子繼續種植培養，直至收獲T3代純合種子，用于后續分析。

2 結果與分析

2.1 忍冬FT及其同源基因的鑒定

基于“華金6號”忍冬的基因組信息，共篩選獲得7個LjFT及其同源基因，分別命名為LjFT（Ljap00024631）、LjFTL1（LjFTlikel，Ljap000102410）、LjFTL2（Ljap00015789）、LjFTL3（Ljap00015953）、LjFTL4（Ljap00018074）、LjFTL5（Ljap00028125）、LjFTL6（Ljap00028946），其蛋白氨基酸序列長度在71 aa（LjFTL1）到174 aa（LjFT、LjFTL2）之間，平均長度為152 aa，分子量在8400.8 Da（LjFTL1）至19 675.16 Da（LjFT）之間，理論等電點在5.74（LjFTL6）至10.72（LjFTL1）之間，不穩定指數均大于40，是不穩定蛋白；親水性平均值均為負值，為親水性蛋白。亞細胞定位預測結果表明，LjFT、LjFTLI、LjFTL5定位于葉綠體，LjFTL4定位于過氧化物酶體，LjFTL2、LjFTL3、LjFTL6定位于細胞質中（表2）。

2.2 忍冬FT及其同源蛋白的多序列比對及系統進化分析

利用DNAMAN軟件將忍冬和擬南芥FT及其同源蛋白的氨基酸序列進行多序列比對（圖1），發現LjFT及其同源蛋白之間片段同源性為45.79％，LjFT含有決定其功能的重要氨基酸位點Y（第84位的酪氨酸，Tyr）和Q（第139位的谷氨酸，Gln），另外，第137位的色氨酸（Trp，W）相對保守且是必需的。

本研究利用MEGA x中的最大似然法構建了忍冬LjFT與擬南芥、大豆、玉米、毛果楊FT及其同源蛋白之間的系統進化樹（圖2）。參考擬南芥序列的分類依據，所有蛋白可分為3個亞組，分別是TEL1 - like、MFT - like、FT - likeoLjFTL1、LjFTL2、LjFTL3、LjFTL4位于TEL1 -like亞組，LjFTL5位于MFT-like亞組，LjFT、LjFT6位于FT - like亞組。其中LjFTL6與毛果楊PNS99216親緣關系最近。

2.3 忍冬FT及其同源基因的基因結構與保守基序分析

利用GSDS 2.0在線網站對7個LjFT及其同源基因進行結構分析，結果（圖3）發現，LjFT、LjFTL1、LjFTL2、LjFTL3、LjFT24、LjFTL5基因有4個外顯子、3個內含子，LjFTL6只有2個外顯子和1個內含子。進化樹形成了LjFTL2/LjFTL3基因對，兩者具有相似的結構，說明它們可能具有相似的功能。

使用MEME在線網站分析了7個LjFT家族蛋白的保守基序（motif），發現有10個含有不同氨基酸序列的保守基序（圖4），各蛋白的保守基序數目在2-6個之間（圖5），其中LjFT含有5個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4、motif7），LjFTL1含有2個保守基序（motif5、motif6），LjFTL2含有5個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4、motif7），LjFTL3含有5個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif7、motif10），LjFTL4含有4個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4），LjFTL5含有6個保守基序（mo-tif2、motif3、motif5、motif6、motif9、motif10），LjFTL6含有3個保守基序（motif5、motif8、motif9）。

2.4 忍冬FT及其同源基因的表達分析

利用RT-qPCR技術對“華金6號”扦插苗（5月份開花）和一年生實生苗（當年不開花）中LjFT及其同源基因進行表達量分析，發現除了LjFTL1外，其他基因在扦插苗和實生苗中都有表達（圖6）。LjFT在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加，表達量逐漸上升，表明LjFT可能促進開花；而LjFTL2、LjFTL3、LjFT24、LjFTL5和LjFTL6的表達量隨日照時間的增加總體呈下降趨勢，表明LjFTL2-LjFTL6可能抑制開花。LjFT在扦插苗中的表達量明顯高于在實生苗中，而LjFTL5在扦插苗中的表達量明顯低于在實生苗中，這種差異可能是扦插苗和實生苗開花時間不同的重要內在原因。

2.5 忍冬FT在擬南芥開花時間中的功能分析

為驗證LjFT的功能，構建LjFT過表達載體pG-FPGUSplus-LjFT并轉化擬南芥，利用潮霉素篩選陽性植株，利用RT-qPCR對其LjFT表達量進行檢測，結果（圖7）發現，與對照（轉化pGFPGUSplus空載體）植株相比，轉基因陽性植株中LjFT處于超量表達狀態。選取LjFT過表達株系LjFT- OE3、LjFT-OE4及對照Mock株系進行開花時間統計發現，兩個過表達株系的開花時間顯著早于對照株系（P＜0.001），說明過表達LjFT促進擬南芥開花。

3 討論

開花是高等植物發育和繁衍后代中的一個關鍵過程，而FT基因在調控開花過程中起著重要作用。研究表明，FT同源基因在擬南芥、牽牛花（Ipomoea purpurea）、獼猴桃（Actinidia）、板栗（Castanea mollissima）等植物中均存在，且都具有促進植物開花的功能。將西紅花（Crocus sativus）的3個FT基因Csat FT1、Csat FT2、CsatFT3在煙草和擬南芥中過量表達，轉基因植株均表現為提早開花，說明西紅花的3個FT基因具有促進開花的功能。高羊茅（Festuca elata）的FaFT基因受光周期調控，表現出晝夜節律，在長日照條件下過表達FaFT的擬南芥植株比野生型提早開花。水稻（Oryza sativa）OsFTL4在根、莖、節、嫩葉、老葉、葉鞘等不同部位都有表達，在水稻節中的表達量最高：OsFTL4敲除突變體植株與野生型相比提早開花，并且OsFTI4還參與到了水稻的耐鹽和抗旱調控過程。

在本研究中，基于“華金6號”忍冬基因組信息，篩選獲得7個FT及其同源基因，通過與擬南芥FT同源基因進行比對發現，忍冬FT及其同源基因編碼蛋白具有保守的氨基酸位點；系統進化結果發現，LjFT與AtFT和AtTSF在同一亞組。TSF是擬南芥中與FT最接近的同源基因，二者均具有促進開花的功能，因此推測LjFT基因同樣具有促進開花的功能。此外，LjFT及其同源基因形成了LjFTL2/LjFTL3基因對，具有相似的基因結構和保守基序，表明它們可能具有相似的功能。以上結果為進一步研究LjFT及其同源基因在忍冬開花時間調控中的功能提供了線索。

FT作為植物的成花素基因，主要功能是促進植物開花。研究發現，大豆GmFT5a過表達植株在長日照條件下提早開花，小麥TaFT-A3/B3/D3過表達植株在長短日照條件下呈現早花表型。本研究利用RT-qPCR檢測LjFT及其同源基因在忍冬扦插苗和一年生實生苗中的表達水平發現，除LjFTL1外，LjFT、LjFTL2-LjFTL6在扦插苗和實生苗中均有表達，其中LjFT的表達量隨日照時間增加逐漸上升，而LjFTL2-LjFTL6的表達量則隨日照時間的增加總體呈下降趨勢，表明LjFT可能是開花促進子，而LjFTL2-LjFTL6可能是開花抑制子。Ho等研究表明，擬南芥中W位點突變后能把FT促進開花功能轉變為抑制開花。因此，本研究中LjFT與LjFTL2-LjFTL6的表達及功能差異可能與其蛋白序列中W位點的變異相關。為了進一步驗證LjFT是否具有促進開花的功能，本研究利用同源重組的方法構建了LjFT過表達載體，獲得LjFT過表達的轉基因擬南芥植株，與對照擬南芥植株相比，其開花時間明顯提前，說明LjFT具有促進植物開花的功能。結合LjFT在扦插苗和實生苗中的表達量變化，可得出結論：LjFT表達量隨日照時間的增加逐漸上升，促進了忍冬開花。

4 結論

本研究通過生物信息學方法從“華金6號”忍冬基因組中鑒定得到7個LjFT及其同源基因，系統分析發現它們分屬TEL1 -like、MFT -like、FT-like三個亞組。LjFT基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸上升，可能作為開花促進子發揮功能；LjFTL2、LjFTL3、LjFTL4、LjFTL5和LjFTL6基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸下降，可能作為開花抑制子發揮功能。與對照植株相比，LjFT過表達擬南芥植株的開花時間提前，說明LjFT具有促進植物提早開花的功能。本研究結果為解析忍冬開花時間的調控機制提供了重要線索，同時為不同花期忍冬新品種的選育提供了基因靶點。

基金項目：泰山學者工程專項經費資助項目（tsqn202211135）；山東省高等學校青創人才引育計劃“中藥功能基因挖掘及基因組學研究創新團隊”項目；國家現代農業產業技術體系項目（CARS-21）；國家自然科學基金項目（81872963，81903750）；山東中醫藥大學中藥資源可持續利用青年創新團隊項目