微生物實驗教學中固體培養基滅菌方案改良探索

摘要 微生物實驗教學中固體培養基的滅菌至關重要，為了解決實驗教學中存在的問題，文章基于高壓蒸汽滅菌器，對固體培養基滅菌過程中的排氣方式、封口方式、滅菌時間進行了改良優化，總結對比歸納出了一套效率高、保存時間長、重復性好的滅菌方案。該滅菌方式不僅適用于本科生教學實驗，還適用于醫學等科研類實驗室，并能夠為提高實驗室滅菌效率、改善本科實驗教學效果和提升專業人才培養質量提供新思路。

關鍵詞 微生物實驗；固體培養基；高壓蒸汽滅菌；人才培養

中圖分類號：G424 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdk.2025.07.025

微生物培養基的制備和滅菌是保障微生物實驗教學順利開展的基礎，該技術不僅被廣泛應用于科研與教學領域，還是醫學和生物技術類院校為本科生和研究生普遍開設的實驗課程的內容。培養基是微生物實驗室最常用的微生物培養、分離與鑒別基質[1]，其最有效的滅菌方式為高溫高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌器作為微生物實驗室中常用的滅菌設備，主要用于對實驗器械、實驗器具及培養基等進行濕熱滅菌，其滅菌效果直接關系到實驗結果的準確性和可靠性。經調研，培養基的pH 值、成分、顆粒大小、泡沫多少會直接影響高壓蒸汽滅菌效果[2]。此外，在滅菌方式方面，滅菌時間、溫度、壓力、蒸汽飽和度及裝載方式也會影響培養基的滅菌效果[3-4]，而分裝容器并不影響滅菌效果[5]。為了能讓學生在兩個學時內完成實驗過程并且能掌握實驗原理與方法，本文根據以上調研結果進行了多次預實驗，最后確定了一套有效的固體培養基高壓蒸汽滅菌方案：即0.1 MPa 蒸氣壓，121 ℃，自動排氣，單層封口膜加報紙封口，滅菌40 分鐘，在保證固體培養基的營養成分無顯著改變的基礎上，大大提高了滅菌效率，延長了固體培養基的保存時間。本研究結果縮短了滅菌周期、降低了實驗成本，并提升了滅菌效果，其方法可在高校及研究所普及開展。在教學上，改良后的滅菌方案保證了教學的統一性和準確性，提升了該課程的教學質量和教學效能；在人才培養上，提高了學生在實驗過程中提出問題、發現問題、解決問題的能力，增強其專業實驗技能，為未來專業人才儲備夯實了基礎。

1 實驗教學中存在的問題

微生物實驗教學中通過牛肉膏蛋白胨培養基的制備和滅菌使得學生充分了解高壓蒸汽滅菌器的工作原理、方法及應用等，掌握培養基制備流程及儀器操作方法。然而由于教學教材、條件、設備與時間的限制，在日常實驗教學中，常常存在以下困難與問題。

1.1 培養基染菌問題

培養基的制備和滅菌在微生物實驗課程中通常以4 個學時分配到兩周內開展，第一周開展“培養基的制備和滅菌”課程，制備好的培養基在第二周“環境條件對微生物生長的影響”課程中使用。以每周8 個行政班級240 余位學生為授課對象，每次將要制備60 瓶200 mL 的培養基，然而低溫冰箱中難以同時容納大量的固體培養基，加之實驗室中環境復雜，菌種較多，培養基如果滅菌不徹底，極易交叉染菌，這不僅會造成試劑浪費、污染實驗室環境，還會耽誤課程時間，影響實驗效果和進程。

1.2 高壓蒸汽滅菌器的使用問題

安全問題：該儀器本身內部壓力大、溫度高，屬于燙傷、爆炸等安全隱患易發儀器。然而在實驗室中其使用較為普遍，本教學的開展也是為了讓學生在使用該儀器時具備安全意識，并規范該儀器的操作與使用。因此高壓蒸汽滅菌器必須在學生完成具體、專業的培訓后才能使用，且使用過程中必須有實驗老師監督完成各項操作，避免造成安全事故。

時間問題：以本實驗室的高壓蒸汽滅菌器為例，完成一次滅菌大概需要2 小時，而該課程僅兩個學時（1.5 小時），從課程講授、培養基制備到高壓蒸汽滅菌，時間顯然是不充足的。因此在以往的教學中，由教師對學生配備的培養基進行滅菌操作，學生沒有獨立操作，其無法掌握高壓蒸汽滅菌器的使用規范和方法。此外，如果培養基滅菌不徹底導致染菌，將會耗費更多的時間，且影響第二周實驗課程的使用。

滅菌參數設置問題：高壓蒸汽滅菌器各方面的條件設定都影響著最終的滅菌效果，因此需要嚴格把控操作規范和程序設定以確保滅菌的有效性。以實驗教材為準，牛肉膏蛋白胨培養基的配制為棉塞封口、高壓蒸汽滅菌30 分鐘。然而棉塞是傳統封口方式，有以下缺點：脫落的棉絮會污染培養基；定形性不好，密封不嚴密易染菌；在使用過程中無法灼燒滅菌。總結而言，其使用不太方便。教材中針對滅菌的排氣方式未加強調，且多次實驗中滅菌30 min 仍然經常出現染菌情況。因此，本文以此為切入點，針對封口方式、排氣方式和滅菌時間進行實驗調整，并將固定的滅菌方式應用在實驗教學當中，以達到更好的滅菌效果。

1.3 學生實驗技能培養問題

在以往的教學中，為了避免出現安全事故，要求學生將培養基配制完成后，將未滅菌的培養基交給實驗教師滅菌，導致學生無法在課程中完全掌握培養基滅菌的要領，例如培養基配備中的封口方式、pH 值、泡沫多少，在滅菌過程中的滅菌時間、溫度、壓力、蒸汽飽和度及裝載方式等都決定了滅菌的效果。按照本文的方法改良后，可在實驗課程的前期理論講解環節將這些滅菌的細節悉數告知學生，并分組對學生進行滅菌鍋的操作培訓，以提高學生的實驗實操能力、細節把控能力和問題解決能力。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗儀器與試劑

立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠LDZX-50KBS），培養箱（博迅醫療生物儀器有限公司），牛肉膏（批號：20210120，貨號：01-009）、蛋白胨（批號： 20220322，貨號：01-001），均購自北京奧博星生物技術有限責任公司，瓊脂粉（批號：20240618，貨號：507V025），購自北京索萊寶科技有限公司。

1 L牛肉膏蛋白胨固體培養基配方：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，瓊脂20g，水1 L，pH：7.2―7.4。

2.2 實驗方法

本實驗按照控制變量的方法設定不同的高溫高壓蒸汽滅菌條件，0.1 MPa 蒸氣壓，121 ℃ 溫度保持不變，統一使用牛肉膏蛋白胨固體培養基，將培養基溶解均勻后每瓶200 mL 分裝于500 mL 錐形瓶進行高壓蒸汽滅菌。為避免滅菌實驗過程中其他因素的干擾，在條件優化過程中采用統一的裝載方式和分裝容器，從而確保每次實驗變量單一。此外，滅菌之后培養基的存放環境也非常重要，溫度、濕度等環境條件的變化都會影響培養基的保存，因此該研究將滅菌后的培養基保存在固定溫度28 ℃，濕度10%―20%的培養箱中，逐日觀察記錄一周內的染菌情況，如果培養基沒有變化，說明滅菌效果良好，如果培養基出現了雜菌菌落，則說明滅菌不徹底[6]，從而確定最優的滅菌條件。

3 實驗改進內容及結果分析

3.1 滅菌排氣方式的改進

有研究表明，天然培養基應在高壓滅菌后自動排氣，滅菌效果較好[7]。自動排氣為將固體培養基在高壓滅菌30 分鐘后，放置待蒸汽鍋自然冷卻，壓力降至外界大氣壓時，取出培養基；手動排氣為將固體培養基在高壓滅菌30分鐘后，立即緩慢放氣，使蒸汽鍋內壓力降至外界壓力，取出培養基，置于28 ℃ 培養箱，逐日觀察記錄一周內的染菌情況。

實驗效果：固體培養基經手動排氣方式滅菌后第二天已經有染菌情況出現，這說明滅菌不徹底，且第六天已達到100% 染菌，與其相比，自動排氣的滅菌效果較好（表1）。這可能是由于手動排氣加快了滅菌的降溫降壓過程，從而縮短了高溫高壓滅菌時間；手動排氣過程當中滅菌鍋的密閉環境被打破，導致外部空氣雜菌進入。且由于手動排氣無法精確控制排氣量與時間，過量手動排氣也易造成高溫蒸汽灼傷等安全隱患，因此本文選擇安全系數較高的自動排氣，便于學生使用和操作。

3.2 封口方式的改進

找到最佳的滅菌排氣方式之后，以自動排氣方式滅菌，將配置好后的固體培養基分別用一層封口膜、雙層封口膜、雙層報紙、單層封口膜加單層報紙密封后高壓滅菌30 min，將滅菌完成的固體培養基置于28 ℃ 培養箱，逐日觀察記錄一周內的染菌情況。

實驗效果：如表2 顯示，報紙加一層封口膜密封的牛肉膏蛋白胨固體培養基5 天之內保持了零染菌，說明其滅菌效果相對最好。封口膜對培養物無毒害作用，可過濾灰塵，防止細菌污染，透氣性好，耐高壓，能反復使用，報紙雖然容易破損，不能重復利用，但是屬于廢物利用，更能提高滅菌效率，二者的使用均優于傳統的棉塞，且方便學生操作使用，值得采用。

3.3 滅菌時間的改進

找到最佳的滅菌排氣方式和封口方式之后，以自動排氣方式滅菌，并用單層封口膜和報紙對錐形瓶進行封口，分別設定20 分鐘、30 分鐘、40 分鐘及50 分鐘進行滅菌，將滅菌完成的固體培養基置于28 ℃ 培養箱，逐日觀察記錄一周內的染菌情況。

實驗效果：滅菌40 分鐘在一周之內沒有染菌情況出現，其滅菌效果最好，30 分鐘次之（表3）。實驗中有趣的是，滅菌50 分鐘的滅菌效果遠不如40 分鐘，這可能是由于滅菌時間過長導致滅菌后的固體培養基內蒸氣過多，較大的濕度更易染菌。此外，長時間的高溫導致培養基內某個或某些成分的變化，從而導致其更易染菌。

3.4 間歇滅菌提高滅菌效果

找到最佳的滅菌排氣方式、封口方式和滅菌時間之后，以自動排氣方式滅菌，并用單層封口膜和報紙對三角瓶進行封口，將121℃，40 分鐘滅菌一天后的固體培養基置于相同的條件重復滅菌一次，次日于相同的條件再重復滅菌一次，將滅菌完成的培養基置于28 ℃ 培養箱，逐日觀察記錄兩周內的染菌情況。

實驗效果：表4（p82）顯示一周內三個實驗組均無染菌，再觀察一周后，單次滅菌和重復兩次滅菌的實驗組分別于第7 天、第11 天出現了染菌情況，而重復三次滅菌的實驗組兩周內均無染菌情況出現，這說明間歇重復滅菌會提高滅菌效率。有研究表明，培養基的高壓蒸汽滅菌可以殺滅微生物，也會改變培養基中某些營養物質的存在形式和pH 值，而這種改變更適合于微生物的吸收和利用[8]，因此本文也進行了相關驗證。在對應實驗組無染菌的培養基上接種了大腸桿菌，滅菌三次的固體培養基上菌落的生長速度及形態與一次滅菌的培養基并無不同，這樣就可以重復滅菌來延長固體培養基的保存時間。

4 實驗教學討論與反思

本研究對比了多個高壓蒸汽滅菌條件對微生物教學中培養基污染的影響，確定并優化了固體培養基的高壓蒸汽滅菌條件，即0.1 MPa 蒸氣壓，121 ℃，自動排氣，單層封口膜加報紙封口，40 分鐘，在這種條件下滅菌，固體培養基的營養成分并無改變，且提高了滅菌效率，延長了固體培養基的保存時間。如果需要滅菌更加徹底，保存的時間更長，可以進行固體培養基重復間歇滅菌。但是這種方法的適用范圍如何還有待研究，本文僅驗證了牛肉膏蛋白胨固體培養基經間歇重復滅菌后不影響大腸桿菌的生長，由于不同實驗室的滅菌器設施、環境及培養基種類不盡相同，在使用時需要進行驗證以確定滅菌相關參數的適用性。

該實驗課開展的主要目的是使學生了解和掌握培養基制備和滅菌這一實驗技術和實驗過程。該實驗流程較為簡單，但是高壓蒸汽滅菌器的操作有一定的難度，且學生在操作過程中很多細節難以統一，不好把控，原來的教學方法是由教師在實驗課后為學生制備的培養基進行滅菌，這樣學生并不能了解滅菌實驗技術的原理和操作過程，其動手能力得不到鍛煉，知識儲備也跟不上。經改進后，首先，教師需將實驗儀器設備的工作原理和操作方法，以及本文的相關關鍵操作點、參數設置細節及相關原因等應用多媒體教學方法進行講解，讓學生了解并認識到實驗細節決定實驗結果，提高學生的研學能力，加強研究型人才的培養質量；其次，為解決學生人數較多這一難題，教師可將學生分組，并在學生使用之前以組為單位，教師親自對滅菌設備進行操作演示，確保每個學生都能依照本文的操作方法獨立完成培養基的制備，從而激發學生學習興趣，培養學生動手能力，以實現教學目標。

*通信作者：史雪盟

基金項目：河南農業大學高等教育教學改革研究與實踐項目“研究型人才培養模式下的微生物實驗教學改革”（2024XJGLX110）；河南省高校實驗室研究項目“農業類高校實驗技術人員隊伍建設改革與實踐”（ULAHN202361）。

參考文獻

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