銅死亡相關(guān)基因CDKN2A在診斷香煙煙霧誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病中的價值

[摘要]"目的"探尋銅死亡相關(guān)基因在慢性阻塞性肺疾病（chronic"obstructive"pulmonary"disease，COPD）診斷及疾病進(jìn)展中的價值。方法"通過基因表達(dá)全庫系列（gene"expression"omnibus"series，GSE）10006、GSE11784、GSE19407和GSE8545數(shù)據(jù)集篩選出COPD相關(guān)差異表達(dá)基因，并與先前研究中得出的銅死亡相關(guān)基因進(jìn)行比對，得出所探求的銅死亡相關(guān)差異基因。對GSE8545和GSE19407數(shù)據(jù)集進(jìn)行權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted"gene"co-expression"network"analysis，WGCNA），探索銅死亡相關(guān)基因與COPD表型之間的相關(guān)性。引入GSE20257數(shù)據(jù)集驗證該基因的表達(dá)水平變化，并進(jìn)一步探索吸煙對該基因表達(dá)水平的影響。通過GSE7895數(shù)據(jù)集探索戒煙對該基因表達(dá)水平的影響。進(jìn)一步通過GSE162635數(shù)據(jù)集探求銅死亡相關(guān)差異表達(dá)基因?qū)OPD疾病嚴(yán)重程度的影響。結(jié)果"本研究鑒定出1個潛在銅死亡相關(guān)基因為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A（cyclin-dependent"kinase"inhibitor"2A，CDKN2A）基因，并驗證吸煙可導(dǎo)致肺組織內(nèi)的CDKN2A表達(dá)水平上調(diào)，戒煙后則降回到原來水平。最后本研究驗證CDKN2A表達(dá)水平與COPD預(yù)后相關(guān)并隨嚴(yán)重程度增加而增高。結(jié)論"CDKN2A是與COPD密切相關(guān)的銅死亡相關(guān)基因，具有較高的其診斷潛力且與其嚴(yán)重程度相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"慢性阻塞性肺疾病；銅死亡相關(guān)基因；香煙煙霧；細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A

[中圖分類號]"R563.9""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.15.008

The"value"of"cuprotosis-related"gene"CDKN2A"in"the"diagnosis"of"chronic"obstructive"pulmonary"disease"induced"by"cigarette"smoke

TAN"Yu，"MIN"Lingfeng

Department"of"Respiratory"and"Critical"Care"Medicine，"Northern"Jiangsu"People’s"Hospital"Affiliated"to"Yangzhou"University，"Yangzhou"225001，"Jiangsu，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"value"of"cuprotosis-related"genes"in"the"diagnosis"and"disease"progression"of"chronic"obstructive"pulmonary"disease"（COPD）."Methods"Differential"gene"expression"related"to"COPD"was"identified"through""gene"expression"omnibus"series"（GSE）"10006，"GSE11784，"GSE19407，"and"GSE8545"datasets，"and"compared"with"previously"identified"cuprotosis-related"genes"to"identify"differentially"expressed"genes."Weighted"gene"co-expression"network"analysis"（WGCNA）"was"then"performed"on"GSE8545"and"GSE19407"datasets"to"explore"the"correlation"between"cuprotosis-related"genes"and"COPD"phenotypes."GSE20257"dataset"was"introduced"to"validate"the"gene’s"expression"level"changes"and"further"investigate"the"impact"of"smoking"on"gene"expression"levels."Subsequently，"the"effects"of"smoking"cessation"on"gene"expression"levels"were"explored"by"using"the"GSE7895"datasets."GSE162635"dataset"was"then"utilized"to"investigate"the"impact"of"differentially"expressed"cuprotosis-related"genes"on"the"severity"of"COPD."Results"The"study"identified"cyclin-dependent"kinase"inhibitor"2A"（CDKN2A）"as"a"potential"cuprotosis-related"gene"associated"with"COPD，"confirming"that"smoking"upregulated"CDKN2A"expression"in"lung"tissue，"which"returns"to"baseline"levels"after"smoking"cessation."Finally，"the"study"confirmed"that"the"expression"level"of"CDKN2A"was"associated"with"the"prognosis"of"COPD，"increasing"with"severity."Conclusion"The"study"identifies"CDKN2A"as"a"cuprotosis-related"gene"associated"with"COPD，"and"shows"promising"diagnostic"potential"and"correlation"with"disease"severity.

[Key"words]"Chronic"obstructive"pulmonary"disease;"Cuprotosis-related"gene;"Cigarette"smoke;"Cyclin-dependent"kinase"inhibitor"2A

慢性阻塞性肺疾病（chronic"obstructive"pulmonary"disease，COPD）作為全球第三大死亡原因，每年導(dǎo)致約300萬人死亡[1]。COPD是一種異質(zhì)性肺部狀態(tài)，通常表現(xiàn)為持續(xù)性、進(jìn)行性加重的氣流阻塞[2]。肺功能受損主要歸因于細(xì)胞外基質(zhì)降解上調(diào)、慢性炎癥反應(yīng)、氣道重塑和氧化應(yīng)激等[3]。吸煙是COPD的重要危險因素[4]。香煙煙霧中存在大量的有毒性化學(xué)物質(zhì)，攝入這些物質(zhì)可導(dǎo)致肺部的不可逆性形態(tài)和功能改變[5]。

銅是生物體必不可少的輔助因子，是許多生物過程所必需的重要微量元素[6]。小鼠實驗中得出超過10mg/kg的硫酸銅可引發(fā)小鼠肺出現(xiàn)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，繼而引發(fā)肺損傷和功能障礙[7]。研究表明巨噬細(xì)胞中的促炎劑可顯著引起細(xì)胞微環(huán)境中銅穩(wěn)態(tài)的變化，增加銅的吸收利用并增強(qiáng)殺菌活性[8]；相反，銅的外流可使肺炎鏈球菌感染的肺部模型中的毒力下降，并在逃避免疫防御中發(fā)揮重要作用[9]。銅不是中性粒細(xì)胞胞外陷阱的先決條件，但其過量可對中性粒細(xì)胞胞外陷阱產(chǎn)生影響[10]。COPD是一種多炎癥細(xì)胞及炎癥因子參與的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，肺內(nèi)銅離子水平的增加和下降可影響炎癥細(xì)胞的表達(dá)水平和功能，影響肺組織[10]。銅死亡是一種新型的銅依賴性的細(xì)胞死亡模式，可能對COPD的發(fā)生發(fā)展或預(yù)后存在一定影響[11]。目前大多數(shù)對COPD的生物學(xué)信息研究集中外周血樣本，而外周血樣本并不能直接反映COPD的病理變化[12]。本研究注重氣道上皮及肺組織的微陣列數(shù)據(jù)集，首次探討銅死亡與COPD差異表達(dá)基因之間的中樞基因。

本研究分析來自基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene"expression"omnibus，GEO）的4個COPD氣道上皮有效數(shù)據(jù)庫，篩選出銅死亡相關(guān)靶基因并驗證。通過GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步探索吸煙、戒煙及體外香煙煙霧干擾對肺上皮細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A（cyclin-dependent"kinase"inhibitor"2A，CDKN2A）表達(dá)水平的影響；并根據(jù)既往研究及統(tǒng)計學(xué)分析探索銅死亡相關(guān)靶基因的潛在治療靶點。

1""材料與方法

1.1""數(shù)據(jù)采集

本研究從已有研究中收集10個銅死亡相關(guān)基因，分別為鐵氧還蛋白1（ferredoxin"1，F(xiàn)DX1）、硫辛酰合成酶（lipoic"acid"synthetase，LIAS）、硫辛酰基轉(zhuǎn)移酶1（lipoyltransferase"1，LIPT1）、二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide"dehydrogenase，DLD）、二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶（dihydrolipoamide"S-acetyltransferase，DLAT）、丙酮酸脫氫酶E1亞基α1（pyruvate"dehydrogenase"E1"subunit"alpha"1，PDHA1）、丙酮酸脫氫酶E1亞基β（pyruvate"dehydrogenase"E1"subunit"beta，PDHB）、金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1（metal"regulatory"transcription"factor"1，MTF1）、谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）和CDKN2A[13]。信使RNA（messenger"RNA，mRNA）表達(dá)數(shù)據(jù)集基因表達(dá)全庫系列（gene"expression"omnibus"series，GSE）10006、GSE11784、GSE19407、8545、GSE20257、GSE7895、GSE162635從GEO數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2""差異表達(dá)分析

所有數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫中下載并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用R軟件的芯片數(shù)據(jù)線性模型包標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異表達(dá)分析，通過圖形語法繪圖系統(tǒng)第二代（grammar"of"graphics"plot"2，ggplot2）包創(chuàng)建主成分分析（principal"component"analysis，PCA）圖和火山圖[14]。

1.3""WGCNA及基因集合富集分析

通過R軟件包WGCNA分析基因表達(dá)譜，得出與疾病表型最相關(guān)的模塊，收集Plt;0.05的模塊基因[15]。基于GSE20257數(shù)據(jù)集，使用R軟件的clusterProfiler包進(jìn)行數(shù)據(jù)的基因集合富集分析（gene"set"enrichment"analysis，GSEA）。

1.4""受試者操作特征曲線

通過R軟件的接收者操作特征工具包（package"for"receiver"operating"characteristic，pROC）進(jìn)行受試者操作特征曲線（receiver"operating"characteristic"curve，ROC曲線）分析，以確定靶基因的敏感度和特異性，并通過ggplot2包進(jìn)行結(jié)果的可視化。結(jié)果通過ROC曲線下面積（area"under"the"curve，AUC）進(jìn)行量化，AUCgt;0.6為具有診斷意義[16]。

1.5""靶向微小RNA、小核RNA和長鏈非編碼RNA預(yù)測

通過微RNA集成網(wǎng)絡(luò)分析工具（microRNA"integrated"network"analysis"tool，miRNet）數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶向微小RNA（microRNA，miRNA）；RNA相互作用百科全書（the"encyclopedia"of"rna"interactomes，ENCORI）數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶向miRNA、小核RNA（small"nuclear"RNA，SncRNA）、長鏈非編碼RNA（long"non-coding"RNA，lncRNA），并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

2""結(jié)果

2.1""COPD氣道上皮細(xì)胞中銅死亡相關(guān)差異表達(dá)基因

首先確定GSE10006、GSE11784、GSE19407和GSE8545數(shù)據(jù)集，并進(jìn)行PCA分析，見圖1A至圖1D；以差異倍數(shù)[log2"fold"change，log2（FC）]的絕對值gt;0.5和Plt;0.05為閾值，篩選差異表達(dá)基因，并根據(jù)結(jié)果繪制上述4個數(shù)據(jù)集的火山圖，見圖2A至圖2D。韋恩圖顯示4個數(shù)據(jù)集共有差異表達(dá)基因521個，見圖2E。本研究收集10個銅死亡相關(guān)基因，這些基因與上述521個共有差異表達(dá)基因存在一個重復(fù)基因——CDKN2A，見圖2F。

2.2""CDKN2A為COPD密切相關(guān)的銅死亡相關(guān)模塊基因

本研究使用WGCNA探討臨床特征與基因之間的相關(guān)性。確定GSE8545最佳軟閾值為3，GSE19407最佳軟閾值為2。GSE8545中褐色模塊的相關(guān)性最高，共包含371個相關(guān)基因，見圖3。GSE19407中黃色模塊的相關(guān)性最高，共包含978個相關(guān)基因，見圖4。用上述2個數(shù)據(jù)集得出的相關(guān)基因分析得出167個核心基因，見圖5A，其中CDKN2A是銅死亡相關(guān)共有基因，見圖5B。本研究通過WGCNA及差異分析共同得出CDKN2A是與COPD密切相關(guān)的銅死亡相關(guān)基因。

2.3""預(yù)測CDKN2A的靶向miRNA、SncRNA和LncRNA

本研究通過miRNet網(wǎng)站預(yù)測CDKN2A的靶向miRNA，結(jié)果顯示CDKN2A共有31個靶向miRNAs及31對mRNA-miRNA，見圖6A。本研究進(jìn)一步通過PubMed數(shù)據(jù)庫篩選出與COPD相關(guān)的miRNA共3個，分別為hsa-mir-16-5p、hsa-mir-24-3p、hsa-mir-"191-5p[17-19]；并通過ENCORI數(shù)據(jù)庫構(gòu)建mRNA-"miRNA-SncRNA網(wǎng)絡(luò)圖和mRNA-miRNA-LncRNA網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6B和圖7。

2.4""GSE20257鑒定CDKN2A的表達(dá)水平與診斷價值

利用GSE20257數(shù)據(jù)庫鑒定CDKN2A的表達(dá)。結(jié)果表明在COPD患者與非吸煙健康受試者之間的表達(dá)差異與預(yù)測結(jié)果一致，見圖8A。然后進(jìn)行GSEA以確定COPD患者與非吸煙受試者的功能富集，得出結(jié)果與CDKN2A相比較。結(jié)果表明CDKN2A主要位于同種異體移植排斥通路[富集得分的標(biāo)準(zhǔn)化值（normalized"enrichment"score，NES）=1.511；P=0.017]和腫瘤蛋白53（tumor"protein"53，P53）通路（NES=1.525；P=0.017），見圖8B和圖8C。本研究使用GSE20257中COPD患者與健康受試者的數(shù)據(jù)創(chuàng)建ROC曲線，見圖8D。結(jié)果表明CDKN2A的AUC為0.682（95%CI：0.557～0.806），說明CDKN2A對COPD患者具有一定的診斷價值。

2.5""吸煙與CDKN2A差異表達(dá)之間的聯(lián)系

吸煙是COPD發(fā)生的重要致病因素，為進(jìn)一步探索吸煙是否對CDKN2A的表達(dá)上調(diào)具有影響，本研究使用GSE20257數(shù)據(jù)集，包括42名不吸煙者、51名吸煙者、23例COPD患者。本研究對不吸煙者與COPD患者、不吸煙者與吸煙者、吸煙者與COPD患者進(jìn)行比較。對3個數(shù)據(jù)集構(gòu)建火山圖，見圖9A至圖9C，并標(biāo)注出CDKN2A。非吸煙者與COPD數(shù)據(jù)集的火山圖表明CDKN2A在COPD患者中的表達(dá)水平明顯上調(diào)；不吸煙者與吸煙者數(shù)據(jù)集的火山圖表明CDKN2A在吸煙者中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，但在COPD患者的表達(dá)水平?jīng)]有上調(diào)；吸煙者與COPD患者數(shù)據(jù)集的火山圖表明CDKN2A的表達(dá)水平無顯著差異。通過箱式圖進(jìn)一步證明，CDKN2A在COPD患者的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且略大于吸煙者中相關(guān)基因的上調(diào)水平，而COPD患者與吸煙者相比無顯著差異，見圖9D。為進(jìn)一步探索戒煙對CDKN2A表達(dá)水平的影響，本研究對GSE7895數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。結(jié)果顯示戒煙者的CDKN2A表達(dá)水平恢復(fù)到與不吸煙者一致的水平，見圖9E。

2.6""影響CDKN2A在COPD患者中表達(dá)差異的探索

本研究基于GSE162635數(shù)據(jù)集篩選出89個COPD樣本中CDKN2A的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中輕中度COPD的CDKN2A表達(dá)水平低于COPD重度極重度，見圖10。

3""討論

COPD是一種多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子參與的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，肺組織內(nèi)銅離子的穩(wěn)態(tài)受到炎癥細(xì)胞調(diào)節(jié)并對炎癥細(xì)胞的功能表達(dá)產(chǎn)生影響，銅離子是銅依賴性細(xì)胞死亡模式的重要影響因子。銅死亡對COPD的發(fā)生發(fā)展存在一定影響。

本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集，最終篩選出CDKN2A這個銅死亡相關(guān)共有基因。之后構(gòu)建CDKN2A的miRNA互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，最終得出3個miRNAs與COPD相關(guān)。其中，hsa-mir-16-5p在吸煙者中顯示出表達(dá)差異且具備一定反映COPD易感性的潛力[17]。hsa-mir-24-3p的下調(diào)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而增加對肺氣腫的易感性[18]。此外，hsa-mir-191-5p也在暴露于生物質(zhì)煙霧的COPD患者中表達(dá)上調(diào)[19]。本研究分析表明吸煙的確可導(dǎo)致肺組織內(nèi)CDKN2A表達(dá)水平上調(diào)，尤其患有COPD時上調(diào)更顯著，而在戒煙后受試者的CDKN2A表達(dá)水平降至原水平。所以有理由相信戒煙對COPD患者的重要性。不僅如此，在重度及極重度COPD患者中的CDKN2A表達(dá)水平顯著上升，表明CDKN2A的表達(dá)水平與COPD患者嚴(yán)重程度相關(guān)。

CDKN2A在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。CDKN2A啟動子的甲基化可作為診斷的生物學(xué)標(biāo)志物[20]；且CDKN2A的高甲基化也可一定程度上作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)，其功能缺失也可減弱非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點阻斷的治療效果[21]。CDKN2A作為銅死亡相關(guān)基因，可增強(qiáng)數(shù)種化合物的殺傷作用，在銅離子載體誘導(dǎo)死亡即銅死亡相關(guān)途徑中發(fā)揮促進(jìn)作用[11]。本研究證明CDKN2A在COPD患者中的表達(dá)水平明顯增高且對COPD具有較高的診斷價值，是銅死亡相關(guān)的中樞基因。本研究表明吸煙者肺組織中的CDKN2A表達(dá)水平明顯高于不吸煙者，戒煙后恢復(fù)至不吸煙者水平。此外，CDKN2A基因被認(rèn)為是檢測細(xì)胞衰老的相關(guān)生物標(biāo)志物，在細(xì)胞衰老中發(fā)揮作用。研究表明清除香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠中的衰老細(xì)胞可恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，改善肺組織的病理改變，這可能對COPD的治療具有一定積極意義[22]。

為確定CDKN2A在COPD中的具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步構(gòu)建動物模型進(jìn)行研究。本研究存在一定局限性：首先，銅死亡作為最新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，在作用機(jī)制和相關(guān)基因方面仍需進(jìn)一步探索，目前本研究只能通過既往已發(fā)表的文獻(xiàn)查詢銅死亡相關(guān)基因；其次，目前很少有研究探討銅死亡在COPD中的作用，所以無法證明其在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用及CDKN2A在銅死亡途徑中發(fā)揮的作用；最后，需要設(shè)計和開展更進(jìn)一步的生物學(xué)實驗以驗證CDKN2A在COPD發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中的作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–02–04）

（修回日期：2025–05–08）