籽用美洲南瓜CpMLO基因家族鑒定及響應白粉病脅迫的功能初探

MLO基因家族是植物特異性基因家族，根據物種的不同，其成員數量為 7～39 個[]。其蛋白的特征是存在7個跨膜結構域[2]，而另一個特征是在C端區域存在鈣調素結合結構域，該結構域可能與感知鈣信號和介導各種信號級聯有關[3]。MLO蛋白序列也具有幾種高度保守的氨基酸，其中一些氨基酸被認為對蛋白質的結構、功能和穩定性至關重要[4-6]。MLO蛋白通常被分為7個明確的分支（ I～II ），其中分支V和V分別在單子葉和雙子葉的MLO蛋白中與白粉病（Powderymildew，PM）易感性相關[1，7]。在許多物種中，如大麥、番茄和蘋果，來自這兩個分支的MLO基因（分別在單子葉和雙子葉中為N和V）在PM感染時上調[8-10]。也有研究表明，這些基因的過表達導致對病原體的易感性增強[9]。此外，許多物種通過基因沉默或基因編輯使這些基因失去功能，導致對PM的抗性增加或完全免疫[11-14]

白粉病又稱“白毛病”，是籽用美洲南瓜生產中的重要病害之一，影響籽用美洲南瓜的正常生長，發病后期使葉片無法正常進行光合作用以提供營養，導致收獲時籽粒不飽滿、果實產量及品質下降，嚴重影響到籽用美洲南瓜產業的發展。目前，對甜瓜、黃瓜白粉病相關基因MLO的研究報道較多，但在南瓜屬植物上研究較少。隨著南瓜屬基因組的公布，為全面分析籽用美洲南瓜中的MLO基因家族提供了機會。本試驗以南瓜屬公布的基因組數據為基礎，對籽用美洲南瓜MLO基因家族成員進行鑒定，并對篩選出的MLO基因進行白粉病脅迫下表達模式分析。從中選擇表達最顯著的MLO15過表達轉化煙草進行功能驗證，對其響應白粉病功能進行初步鑒定。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為籽用美洲南瓜（CucurbitapepoL.）感病品系（M3）、煙草K326，來源于內蒙古農業大學王萍教授課題組。煙草白粉病菌由河南科技學院郭衛麗老師提供。籽用美洲南瓜和煙草幼苗在人工氣候室中培養，溫度保持在 ，光周期為 18h/6h （白天和黑夜）。籽用美洲南瓜幼苗長至2葉1心時接種白粉病菌，煙草長至6葉1心時接種白粉病菌，在 6h，12h，24h 后采集葉片。以未接種白粉病菌的葉片作為對照（CK）。所有樣品立即在液氮中冷凍，并保存在-80^°C ，備用，所有樣品均3個重復。

1.2方法

1.2.1籽用美洲南瓜MLO基因家族鑒定從擬南芥數據庫（http：//arabidopsis.org）中獲取15條擬南芥MLO成員為模板，對籽用美洲南瓜基因組進行本地BLASTp比對，設置E-value為（204號 1×10^-20 。利用在線程序PFAM（http：//pfam.xfam.org/search） 和 CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對候選MLO 基因驗證保守結構域[15]。使用在線Ex-Pasy程序（http：//www.expasy.org/tools/）預測MLO成員的生物物理性質，如長度、分子質量（MW）、等電點（pI）[16]。

1.2.2多序列比對和系統發育分析為了研究C_PMLO 家族的進化關系和分類，首先使用ClustalW工具對所有 C_PMLO 及擬南芥、水稻等雙子葉和單子葉植物MLO的氨基酸序列進行多序列比對。根據比對結果，利用MEGAX軟件使用最大似然法（ML）構建系統發育樹[17]

1.2.3基因結構分析和保守基序檢測使用在線程序 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/），通過比較內含子一外顯子與其對應的基因組序列，繪制內含子一外顯子結構示意圖。CpMLOs的保守基序通過在線工具MEME（http：//meme.ebi.edu.au/）檢測。參數設置如下：每個序列出現0次或1次；最大motifs數量為10個；其他可選參數設置為默認值[18]

1.2.4染色體定位、基因重復和共線性分析為了進一步研究CpMLO的進化，首先繪制籽用美洲南瓜中MLO成員的分布圖。從GFF3注釋文件中檢索所有MLO基因在染色體上的位置，并使用 TBTOOLS可視化染色體位置[19]。為了鑒定CpMLO家族的串聯重復和片段重復，所有CpMLO 氨基酸序列用BLASTp比對，e值為 1× 10^-10 。位于同一染色體上的兩個或多個基因以200kb 的距離排列，并且BLASTp分析的同源性超過 70% ，可以定義為串聯復制事件[15]。使用

MCScanX程序識別片段重復事件，參數默認[20]。

利用Circos程序繪制共線性圖。

1.2.5 RNA提取及實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用試劑盒（RNAsimpleTotalRNAKit，北京天根生化科技有限公司，北京）提取籽用美洲南瓜葉片總RNA。使用TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA synthesis Super-Mix（北京全式金生物技術有限公司，北京）反轉錄cDNA。采用TBGreenPremixExTaq II（TaKaRa北京寶生物公司，北京）在FTC-3000P（FunglynBiotech，加拿大）上進行實時定量PCR（RT-qPCR），反應體系及反應程序參照說明書，所有處理均采用3個重復。引物如表1所示。用2^-ΔΔcT 法計算相對表達量[21]。內參基因為 CAC基因[22]

1.2.6籽用美洲南瓜CpMLO15功能的初步驗證在前期研究基礎上，采用無縫克隆的方式進行過表達載體的構建，并轉化煙草，將CpMLO15基因過表達植株移栽到穴盤中，待植株長到六葉一心時噴白粉病病菌，觀察白粉病發病情況并取樣。在接種后 0.6，12，24，48h ，取其同一葉位葉片測定其生理指標，CAT、SOD、POD活性以及MDA含量的測定均參照李合生[23]的方法。在白粉病脅迫第3天后，測過表達植株及野生型植株抗病基因（NPR1、PDF1.2、PAL、PR5、PR1a）的相對表達量（以NtEF1-a為內參基因）。

1.2.7 亞細胞定位 參考賀傲兵[24]亞細胞定位的方法。

1.2.8數據處理與分析利用Excel2019進行圖表繪制，SPSS18.0進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1CpMLOs鑒定及理化性質分析

經過人工篩選，并對搜索結果進行驗證，在南瓜基因組內共鑒定出18個MLO基因，根據其在染色體上的物理位置，將其命名為 CpMLOI～ CpMLO18 。各基因的特征，包括基因數量、序列長度、蛋白質的分子質量和pI如表2所示。隨后對這18個CpMLO的序列分析表明， CpMLO 蛋白序列氨基酸數量從 412（CpMLO15）～614 （CpMLO18）不等，大多數MLO蛋白至少含有500個氨基酸。這些蛋白的分子質量和等電點分別在 48.68ku（CpMLO15）～70. 09ku（CpMLO18） 和6.44（CpMLO18） ～9 .64（CpMLO8）。該基因家族含有 4～10 個不等的跨膜區。亞細胞定位預測顯示CpMLO均定位到細胞膜中。

2.2CpMLOs系統發育、保守基序及基因結構分析

為了研究籽用美洲南瓜MLO家族的進化關系和分類，利用18個CpMLO蛋白和已知的擬南芥Arabidopsisthaliana（15）、蘋果Malusdom-estica（1）、桃Prunuspersica（1）、水稻Oryza sa-tiva（1）、大麥Hordeumvulgare（1）和小麥Triticumaestiuum（3）MLO蛋白構建進化樹。根據前人研究將這些蛋白質分為7個分支（ I～ VI），其中I、Ⅲ和V組數量最多有4個 CpMLO 蛋白，Ⅱ組有3個蛋白，Ⅲ組有6個蛋白，V組有2個蛋白質，VI組有1個蛋白（圖1）。

采用在線MEME軟件對18個 C_PMLO 基因的氨基酸序列進行分析，獲得10個保守基序（圖2-A）。結果表明，大部分基因均存在8個以上的保守基序，而在不同的進化中的一些基因失去了保守的基序；其中，CpMLO2、CpMLO3、CpMLO8 和 CpMLO15 缺乏Motif7，CpMLO10基因和CpMLO14缺乏Motifl。此外，只有5個CpMLO（CpMLO6、CpMLO7、CpMLO9、CpM-

LO12、CpMLO17）基因含有所有的基序。結果表明，這些保守基序相對保守，并且其具有相似的位置分布。

基因結構分析表明，MLO基因家族結構復雜（圖2-B），并且每個基因中都存在12個以上的內含子。發現CpMLO5和CpMLO10兩端沒有UTR區域，3個基因（CpMLO2、CpMLO3和C_PMLOI8 ）在一端缺乏UTR區域。基因結構分析表明，同一分支中的基因具有相似的內含子和外顯子分布模式（圖2-C）。

2.3 CpMLOs 基因的染色體定位及共線性分析

18個MLO基因被定位到各個染色體上（圖3），其中除了染色體Chr3、 Chr4 、 Chr7 、Chr15和Chrl8外，其他染色體均分布 1～2 個 C_PMLO 基因；而在3條染色體Chr1、 Chr10 和 Chrl6上各發現2個MLO基因并未發現串聯重復。共有5對 C_PMLO 基因（CpMLO3和CpMLO18、CpM-LO2和 CpMLO7，CpMLO4 和CpMLO15、CpM-LO11和 CpMLO16，CpMLO9 和 CpMLOI7. 參與片段重復（圖4）。為了探究籽用美洲南瓜與不同物種（擬南芥、水稻、黃瓜和甜瓜）MLO基因的進化關系，對5種物種進行共線性分析（圖5），在5個物種中發現了50對同源基因對，涉及47個基因。其中黃瓜、甜瓜與籽用美洲南瓜MLO基因共線性最多，而與水稻中僅存在1對。

2.4 CpMLOs 基因順式作用元件分析

為了了解籽用美洲南瓜MLO基因家族啟動子區域的順式元件，選取基因上游 2kb 序列進行分析。結果如圖6所示， C_PMLO 基因家族的順式元件可分為兩類：一類與生長發育有關，包括WRKY轉錄因子結合元件（W-box）和4個光響應元件（Spl、G-box、Box4和GT1-motif）；另一類與脅迫反應有關，包括脫落酸響應元件（ABRE）、茉莉酸響應元件（CGTCA-motif和TGACG-mo-tif）、干旱脅迫響應元件（MBS）、防御和脅迫響應元件（TC-richrepeats）、低溫脅迫響應元件（LTR）、厭氧元件（ARE）和與生物脅迫相關的元件（MYB和MYC）。所有的 C_PMLO 基因啟動子都含有光響應元件和生物脅迫相關元件；有12個C_PMLO 基因含有茉莉酸響應元件；13 個 C?M- LO基因含有脫落酸響應元件；8個 C_PMLO 基因含有干旱脅迫響應元件；11個 C_PMLO 基因含有低溫響應元件。

2.5 CpMLOs 基因表達模式分析

為了了解MLO第V家族中 C_PMLO 在籽用美洲南瓜白粉病脅迫下的表達模式，對其進行qPCR分析。

如圖7所示，與對照相比，白粉病脅迫下CpMLO2 、CpMLO4、CpMLO7和 CpMLOI54 個基因在 ^12h 和 24h 時都上調表達，尤其以CpMLO15在 ^12h 時表達量就達到極顯著差異1 （Plt;0. 01） 。因此，本試驗選擇 CpMLOI5 基因進行后續功能驗證。

2.6T0代轉基因煙草株系感病性表現及生理生化指標分析

在前期的研究基礎上，通過無縫克隆構建了煙草轉基因載體，通過過表達MLO15轉基因煙草株系，研究對白粉病的敏感性，分別對野生型煙草和過表達煙草進行白粉病菌處理，觀察接菌后的煙草表型。由圖8可知，在接種白粉病菌7d后，野生型煙草只有一片葉出現少量的白斑，而轉基因煙草幾乎所有葉片都出現白斑且有一兩片葉有大面積白斑。

2.7 亞細胞定位

為驗證CpMLO15的亞細胞定位，以空載為對照，將含有重組質粒的農桿菌轉化煙草后進行

熒光觀察，結果見圖9。對照的信號散布于細胞的不同區域，而試驗組的熒光信號僅限于細胞膜，這與生物信息學預測結果一致。

2.8抗氧化酶活性及丙二醛含量

由圖10可知，處理 ^0h 時，轉基因株系OE植株葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫（CAT）活性均低于野生型煙草，其間差異不顯著；隨著處理時間的延長，野生型煙草葉片和轉基因煙草葉片SOD、POD活性均呈現增加的趨勢，在 ^12h 出現顯著差異（ Plt; 0.05），轉基因植株株系中CAT活性相比于野生型植株株系在 24h 達到顯著差異；轉基因株系中丙二醛（MDA）含量較野生型株系中的含量高，在⁶h 和 12h 達到顯著，在 ⁶h 轉基因煙草是野生型煙草的2倍。以上結果表明，過表達CpM-LO15增加了煙草對白粉病的易感性。

2.9T0代轉基因煙草株系抗病相關基因表達量分析

在接種白粉病菌處理后，轉基因株系中激素通路的關鍵基因（NPR1）、防御酶類相關基因（ PAL ）的相對表達量相對于野生型煙草都有不同程度的降低，且均達到極顯著差異（ Plt;0.01） 。與野生型相比，轉基因野草PAL下調表達了7.3倍，PR5下調表達1.9倍， PRla 下調表達3倍（圖11）。

3討論

MLO被認為是一個高度保守的基因家族，廣泛存在于各種植物中。其中一些MLO基因已被廣泛認為在植物病害中起關鍵作用，特別是在白粉病菌脅迫中[25]。此外，已經發現MLO基因參與各種發育、生物和非生物脅迫的響應[26]。然而，不同物種間基因的生物學功能特征存在差異。到目前為止，甜瓜[27]、黃瓜[28]、南瓜[29]等植物對MLO基因家族進行系統的鑒定和分析。隨著美洲南瓜基因組的發布，本研究系統地分析了籽用美洲南瓜中的MLO基因家族及在白粉病菌脅迫下的表達變化。本研究結果為更深人的研究C_PMLO 基因功能提供了理論依據。

本研究構建了籽用美洲南瓜與其他6個物種間的系統發育樹，參考前人對其的分類命名[1]，共確定了7個不同的分支，其中 C_PMLO 基因均勻地分布于其中6個分支中，而第V分支均為單子葉植物。系統發育樹表明，在第V分支中，4個CpMLO基因 ∵CpMLO2 、CpMLO4、CpMLO7、CpML015）與 AtMLOQ?AtMLO6 和AtMLO12聚類在一起，而研究表明，擬南芥中這些基因與白粉病菌敏感性相關[30]，表明與之聚類的 C_PMLO 基因可能含有同樣的功能。有研究motif1和motif2存在于具有白粉病菌敏感性的第V分支中[9，31]，但在其他分支也發現了相同的保守基序。保守基序分析發現，10個motif并不存在于所有CpMLO中，與前人研究相似[32-3]

基因組復制事件在基因組大小和基因功能多樣化方面起著重要作用，因為復制事件可以產生具有新功能的基因[34]。在高等植物中，串聯重復事件和片段復制事件是導致基因家族擴增的主要過程[35]。在本研究中，18個CpMLO 家族成員中，共有10個成員參與片段復制，并未發現串聯重復，表明該家族的擴增是由于基因的片段復制。基因的片段復制可以產生其功能冗余，可能具有不同的表達模式[15]。本研究中，第V分支的C_PMLO 基因存在片段復制事件，其在白粉病菌的脅迫下均上調表達，但表達趨勢并不相同。同源基因通常被認為在不同的生物體中保留相同的功能[36]。在黃瓜[37-38]、甜瓜[39]和擬南芥[40]中發現大量與籽用美洲南瓜MLO同源的基因，表明其可能存在相同功能。

有研究表明，mlo突變體植株可以抑制病原菌吸器的形成或調節乳突反應增加細胞壁厚度[41]，從而抵抗病原菌的侵染。此外，MLO基因家族第V分支是雙子葉植物特有的分支，被證明與白粉病菌相關[42]。在本研究中， CpMLO2 、CpMLO4 和 CpML15 的表達量在白粉病菌侵染感病品系時顯著提高。在中國南瓜中也有類似的結果[43]，推測不同品系的基因型對白粉病菌的敏感程度不同。

MLO基因在其他作物上對白粉病的敏感性也有相關報道，如甜瓜 CmMLO2 在受到白粉病菌脅迫時表達顯著上調，構建沉默載體轉化甜瓜后，接種白粉病菌發現其植株對白粉病菌有一定的抗性，結果表明甜瓜 CmMLO2 是一個易感基因[39]；黃瓜CsMLO1基因的缺失，使用CRISPR/Cas9介導的誘變 CsaMLOamp; 基因導致植株對白粉病的抗性增強[37-38]；辣椒 CaMLO2^[44] 在擬南芥中過表達增強了對丁香假單胞菌的敏感性，侵染病后其活性氧含量及電導率相較于野生型植株高；HbMLO-12在轉基因擬南芥中的過表達可以提高植物白粉病的易感性，反之，HbMLO-12基因沉默的擬南芥對白粉病的抗性增強[45]，與本試驗的研究結果相似。

綜上所述，本研究從籽用美洲南瓜中鑒定出18個MLO基因并進行具體分析，并明確其第V家族基因在白粉病菌脅迫下的表達模式，推測CpMLO2，CpMLO4 和 CpMLOI5 可能是感病基因，前期克隆了 CpMLOI5 ，本研究通過將CpM-LO15遺傳轉化煙草，成功獲得轉基因株系，在接種白粉病菌后，在煙草中過表達CpMLO15導致相較于野生型更易感染白粉病菌，其SOD、POD、CAT活性相比于野生型的低，而MDA含量相對較高，抗病基因的表達量降低。過表達CpM-LO15增加了煙草對白粉病的易感性。

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Identification and Functional Characterization of CpMLO Gene Family in Cucubita pepo L. and Its Role in Response to Powdery Mildew Stress

LIU Xian，WANG Ping and XU Ke （College of Horticulture and Plant Protection，Inner Mongolia Agricultural University，HohhotOloooo，China）

Abstract Investigating the MLO gene family in Cucurbita pepo （seed pumpkin） provides theoretical reference to support disease-resistant breeding and marker-assisted selection in this species. In this study，the C_PMLO gene family was identified from the Cucubita pepo genome，and the subcellular localization of the CpMLO15 protein was analyzed using bioinformatics analysis. The function of CpM- 1 LO15 was verified by tobacco transformation experiments. The results showed that 18MLO genes were identified from the Cucubita pepo genome. Phylogenetic analysis revealed that these MLOs clustered into seven clades，and gene structure analysis showed that genes within the same clade shared similar intron一exon structures. Analysis indicated that the MLO gene promoters contain numerous cis-acting elements related to growth，development，and stress responses. Moreover，expression pattern analysis suggested that CpMLO2，CpMLO4 and CpMLOI5 may be involved in the susceptibility of Cucubita pepo to powdery mildew infection. Subcellular localization analysis confirmed that CpMLO15 was localized to the cell membrane. Overexpression of CpMLOI5 in transgenic tobacco plants increased susceptibility of powdery mildew.

Key WordsCucubita pepo; MLO gene family; Expression analysis; Powdery mildew; Functional analysis

Received 2024-03-21 Returned 2024-05-30

Foundation item Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region （No. 2021MS0305o）； Science and Technology Program of Inner Mongolia Autonomous Region（No. 2021GG0l48，No.2Ol20212）； Special Plan for Plant and Animal Breeding of Inner Mongolia Agricultural University（No.YZGC2017018）.

First authorLIU Xian，female，master student. Research area： vegetable cultivation physiology and molecular biology.E-mail：2388382536@qq. com

Corresponding authorWANG Ping，female，Ph. D，professor，doctoral supervisor. Research area：vegetable cultivation physiology and molecular biology.E-mail：wangping@imau. edu. cn

（責任編輯：成敏Responsible editor：CHENG Min）