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江蘇省雞源沙門菌的分子流行病學特征分析

2025-07-29 00:00:00蘇韋赫吉星張莉莉王佳蕓何濤王冉
江蘇農業(yè)學報 2025年6期
關鍵詞:沙門沙門氏菌毒力

中圖分類號:S852.61 文獻標識碼:A 文章編號: 1000-4440(2025)06-1188-09

Abstract:Inorder toclarifythemolecular epidemiological characteristicsof Salmonella from chickens in Jiangsu province,1 641fecalsamplesofsickchickensfromlarge-scalechickenfarms ineightcitiesofJiangsu province werecolected toisolateSalmonella,andthesensitivityofSlmonellisolatestoantibioticsasdeterminedbymicrobrothdilutionmethod.Basedon the wholegenomesequencing technology,thecarrying status ofdrug resistance genesandvirulence genesof theisolates was analyzed.TeserotypeoftheisolateswasdeterminedbyidentifyingtheantigenicstructureofSalmonella,andtheepidemiological characteristicsofSalmonellin Jiangsu province wereanalyzedbymultilocussequence typing(MLST)andphylogenetic tre.The results showed that 266 strainsof Salmonellwereisolatedfrom1641chickenmanuresamples,andtheisolationratewas 16. 21% . The resistance rates of the isolated strains to ampicillin and sulfamethoxazole were 56.39% and 55.64% ,respectively. Multi-drug resistant bacteria accounted for 53.38% . The proportion of strains carrying sul2, blaTEM-l and tetA genes was 59.40% ,56. 77% and 39.10% ,respectively.A total of 21 ST types wereidentified by MLST,of which ST11 accounted for 49. 62% . The serotypes were mainly enteritis,pullorum disease,typhoid feverand Indiana.TheSalmonella isolateswere divided into five genetic evolution branches.The genetic evolutionrelationship between the same farm isolateswasrela

tivelyclose,andthegeneticrelationshipbetweendiferentfarmisolateswasfar.Theresultsofthisstudyprovideabasisforthe precise prevention and control of Salmonella in chickens in Jiangsu province.

Key words:Salmonella isolated fromchickens;epidemiology;serotypes;multilocus sequence typing;resistance genes;virulence genes

沙門菌以其獨特的革蘭氏陰性特性在自然界中廣泛存在,是一種重要的人畜共患食源性病原菌[]。沙門菌常寄生于人和動物體內,特別是家禽、家畜及寵物的腸道中。目前全球已經發(fā)現2600多種血清型沙門菌[2]。沙門菌每年導致約 1.8×108 例腹瀉疾病,并且造成450余人死亡,在食源性病原菌中毒事件中位居首位[3]

長期以來,沙門菌是中國家禽細菌性流行病最主要的致病菌。目前中國報道的沙門菌血清型已有300多種,其中鼠傷寒、腸炎、雞白痢等血清型最為常見[4]。服用抗菌藥是中國防治沙門菌的重要手段,但抗菌藥的長期濫用,導致沙門菌的耐藥性逐年增加,甚至出現了多重耐藥菌[5]。不同地區(qū)由于流行的沙門菌血清型差異,沙門菌防治的用藥種類以及方式不同,導致中國各地區(qū)沙門菌的耐藥情況存在一定的差異。近50年來,廣東、四川和遼寧分離的沙門菌菌株對磺胺甲惡唑耐藥率較高,而山東省分離的沙門菌菌株對氨芐西林和四環(huán)素耐藥率較高[。因此,區(qū)域性雞源沙門菌的耐藥特征分析對該地區(qū)沙門菌感染的精準防治具有重要意義[7]

隨著生物信息技術的發(fā)展,通過全基因組測序(Wholegenomesequencing,WGS)可以快速獲得沙門菌的分子分型以及耐藥基因攜帶特征,進而揭示沙門菌的進化規(guī)律以及危害風險[8]。省是中國家禽養(yǎng)殖重要省份,雖然已有學者初步開展省雞源沙門菌血清型和耐藥率等表型特征的研究[9-I0],但調查區(qū)域較小,且對沙門菌的耐藥基因及毒力基因缺乏分析。為實現更精準的省沙門菌防治,本研究從省8市規(guī)模化雞養(yǎng)殖場采集病雞雞糞樣本1641份,分離沙門菌,并通過全基因組測序技術,進行省雞源沙門菌的耐藥基因和毒力基因攜帶情況分析,基于血清分型、多位點序列分型(MLST)和系統(tǒng)進化樹分析省雞源沙門菌的流行情況,為地區(qū)雞源沙門菌的精準防治提供科學依據。

1材料與方法

1.1沙門菌的分離鑒定

2016年6月到2020年12月,從、揚州、南通、徐州、常州、淮安、鹽城、宿遷8市的規(guī)模化雞養(yǎng)殖場采集病雞糞便樣本1641份。稱取各樣本25g 新鮮樣本分別放入裝有 225mL 緩沖蛋白陳水(BPW)的無菌采樣袋中,揉搓均勻后放置于 36°C 恒溫搖床,轉速 160r/min 振蕩 12h ,隨后取 1mL 培養(yǎng)后的混合液加入到含有 10mL 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)的容器內, 42°C 培養(yǎng) 24h 。培養(yǎng)結束后,用接種環(huán)取培養(yǎng)液在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基(BS)平板上劃線,于 36°C 培養(yǎng) 36h ,挑取平板上具有金屬光澤的黑色、棕色或灰綠色菌落,使用LB肉湯培養(yǎng),得到沙門菌菌液[11]

1.2 藥敏試驗

采用微量肉湯稀釋法對沙門菌分離株進行抗菌藥物敏感性試驗[12]。測定的抗菌藥有:氨芐西林、磺胺甲惡唑、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、利福平、磷霉素、恩諾沙星。根據CLSI(臨床實驗室標準協會)制定的藥物敏感性判斷標準對試驗結果進行解釋。

1.3 16SrRNAPCR鑒定

使用DP302-2細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司產品)提取上述分離菌株的DNA[13],并對其 I6SrRNA 和invA基因[14]進行擴增,引物如表1所示。PCR反應體系 20μL :上下游引物各 1μL ,EsTaqMaster Mix 10μL ,菌液2μL,ddH2O 6μL 。PCR程序: 949C 變性 5.0min ;94C 變性30.0s,55 C 退火30.0s, 72qC 延伸1.5min,30 個循環(huán); 72°C 延伸 10.0min 。PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳,陽性結果委托擎科生物科技有限公司基于IlluminaHiSeq200O測序平臺(美國Illumina公司產品)進行全基因組測序。

表1invA基因和16SrRNA的擴增引物序列 Table1 Amplified primer sequencesof invA and16SrRNA

1.4 全基因組分析

使用Biostack軟件對測序得到的原始序列進行組裝拼接,利用Prokka軟件對拼接后的基因組序列進行注釋。利用Mash軟件構建沙門菌系統(tǒng)發(fā)育樹。通過iToL在線軟件[15]編輯沙門菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分支網絡。根據法國巴斯德研究所(InstitutPas-teur)的MLST(多位點序列分型)數據庫(https://bigsdb.pasteur.fr/)中7個高度保守的基因(hisD、purE?sucA?aroC?thrA?dnaN 和hemD)序列,分析分離得到的沙門菌基因序列分型(ST)[16]。基于基因組流行病學中心(CGE)的SeqSero2血清分型數據庫(https://www.genomicepidemiology.org/)及測序得到的沙門菌菌株全基因組組裝序列,確定沙門菌的血清型。使用ResFinder和VFDBFinder數據庫分析沙門菌的耐藥基因和毒力基因[17]

2 結果與分析

2.1部分地區(qū)沙門菌的流行情況

省8市1641份雞糞樣品中共分離鑒定出266株沙門菌菌株,分離率為 16.21% 。其中,常州市養(yǎng)雞場采集樣本的沙門菌分離率最高,為 25.12% ;市采集樣本沙門菌分離率最低,為 10.20% :淮安市、南通市、鹽城市、徐州市、宿遷市、揚州市等市采集樣本的沙門菌分離率依次為 11.94%.13.53%.14.42%.15.42% 18.88%.20.68% 。分離菌株血清型占比從高到低主要為腸炎型49. 62% 、雞白痢型 13.53% 、印第安納型10.90% 和鼠傷寒型 9.40% 。其中,腸炎沙門菌在各市雞糞樣本中的檢出率均最高(表2)。

表2沙門菌分離情況及主要血清型占比Table2 The isolationsituationof Salmonella and theproportionofmainserotypes

2.2 藥敏試驗

鑒定得到的266株沙門菌對10種抗菌藥物的敏感性如圖1所示。從圖中可以看出,266株分離菌株對氨芐西林的耐藥率最高,達 56.39% ,其次為磺胺甲噁唑,為 55.64% 。266株沙門菌分離菌株對慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素和多西環(huán)素的耐藥率介于 30%~40% ,對氟苯尼考、利福平和磷霉素的耐藥率介于 10%~30% ,對恩諾沙星的耐藥率最低,為6.39% 。耐3種及以上抗菌藥物的多重耐藥(MDR)菌株為142株,占分離沙門菌總株數的53.38% ,其中,有5株對10種抗菌藥物都具有耐藥性,占分離株總數的 1.50% 。

2.3 耐藥基因檢測

基于耐藥基因預測網站ResFinder從分離得到的266株沙門菌菌株中共檢測得到64個耐藥基因(表3),包括16個氨基糖苷類耐藥基因[aph ( (3′′) -Ib、aph(6)-Idaph(4)-Ia aph (3) -Ia、aac(3)-lva、aph (3) -Ila 1

圖1分離菌株耐藥表型占比Fig.1 Proportion of drug-resistant phenotypes in isolated strains
a:氨芐西林;b:磺胺甲唔唑; 慶大霉素;d:卡那霉素;e:四環(huán)素;f:多西環(huán)素; g :氟苯尼考;h:利福平;i:磷霉素;j:恩諾沙星。

Ib–cr5AA.ant(3′′)-Ia,aac(3)–IIdAA.aadAI,aadA2,aadA5,aa-1 dAI6,aadA22,aadA27,aadDI],12 個 β. -內酰胺類耐藥基因 (bla?CARB-2,bla?CMY-2,bla?CTX-M-14,bla?CTX-M-15,bla?CTX-M-55. blaCTX-M-65 、 blaDHA-l 、 blaoXA 、 blaOXA-l 、 blaOXA-l0 、 blaTEM 、blaTEM-1 )、9個磺胺類耐藥基因 (sull,sul2,sul3,dfrAl, dfrA12dfrA14、dfrA17、dfrA27、dfrA32)、7個四環(huán)素類耐藥基因(tetAtetB、tetC、tetG、tetJ、tetM、tetX4)、6個氯霉素類耐藥基因(catA、catA1、catB3、cmlA1、cmlA5floR)、6個喹諾酮類耐藥基因 (oqxAoqxB,qnrAI.qnrA3.qnrDI,qnrSI)4 個磷霉素類耐藥基因 個大環(huán)內酯類耐藥基因(mphA、mphE)、2個利福平類耐藥基因 (arr-2,arr-3) 。59. 40% 的分離株攜帶磺胺類耐藥基因sul2和 56.77% 的分離株攜帶 β. -內酰胺類耐藥基因blaTEM-I 。氨基糖苷類耐藥基因 aph(3′′)-Ib,aph(6)-Id, (20aadA5,四環(huán)素類耐藥基因 tetA ,氯霉素類耐藥基因floR,磺胺類耐藥基因dfrA17的檢出率均在 20% 以上。 95% 以上的分離株中可以檢出至少1種與耐藥表型對應的耐藥基因,說明耐藥基因型與耐藥表型具有較好的符合率。質粒介導的喹諾酮類耐藥基因 (oqxA,oqxB,qnrSI,qnrAI, qnrA3和qnrD1)與耐藥表型的符合率為 60.71% ,其原因可能是上述耐藥基因僅介導低水平的喹諾酮類耐藥性[18]

表3檢測出的耐藥基因Table 3 The detected drug resistance genes

2.4 毒力因子

基于細菌致病菌毒力因子(VFDB)數據庫,分離得到的266株沙門菌中共預測到160個毒力基因(表4)。黏附類毒力因子 csgA,csgB,csgC,csgD 、csgE、csgF、csgG、lpfD、misL、ratB、shdA、sinH、fimA、fimCfimDfimFfimHfimlfimWfimYfimZ,V型分泌相關基因STM0266、STM0267、STM0287、STM0289、tlde1,I型分泌系統(tǒng)控制基因hilA、hilC、hilD、iacp、iagB、invA、invB、invC、invE、invF、invG、in-vH、invl、invJ、orgA、orgB、orgC、prgH、prgl、prgJ 、prgK、sicA、sipB、sipC、sipD、sicP、spaO、spaP、spaQ、spaR、spaS、sprB、spiC、ssaC、ssaD、ssaE、ssaG、ssaH、ssal、ssaJ、ssaK、ssaL、ssaM、ssaN、ssaO、ssaP、ssaQ、ssaR、ssaS?ssaT?ssaU?ssaV?ssaX?sscA?sscB?sseA?sseB?sseC?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?ssaX?saX sseD、sseE、sseF、sseG、ssrA、ssrB、slrP、sspHl、sspH2、si-pA、sopA、sopB、sopD、sopD2、sopE2、sptP、steA、steB、steC、pipB、pipB2、sifA、sifB、ssel、sseJ、sseL、sseK2,其他相關毒力基因mgtB、mgtC、mig-14、fur、phoP、phoQ、pmrA、pmrB、rpoS的檢出率均在 90% 以上,而外毒素相關基因 cdtB,pltA,pltB 的檢出率較低。此外,含有質粒攜帶的外毒素相關基因 spvB?spvC?spvD 的分離株分別為191株、193株和193株,這些基因是導致全身嚴重系統(tǒng)性疾病必不可少的毒力基因,大多存在于腸炎和鼠傷寒沙門菌中, spv 毒力基因的缺失會導致沙門菌的毒力顯著減弱[9]

表4檢測出的毒力基因Table 4 The detected virulence genes
續(xù)表4Continued4

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

266株沙門菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育關系如圖2所示。從圖中可以看出,266株沙門菌分離株可劃分為5個遺傳進化分支,各個分支內菌株攜帶的耐藥基因和毒力基因類型和數量較為相似。與SeqSero2血清分型數據庫比對后,266株沙門菌分離株可分為15個不同的血清型,其中腸炎、雞白痢、印第安納、鼠傷寒為主要流行血清型,菌株占比分別為49.62% 、13. 53% 、 10.90% 和 9.40% 。266個菌株的多位點序列分型(MLST)共獲得21個不同的序列分型(ST),其中ST11為優(yōu)勢分型,占比達 49.62% 。同一ST型有可能位于不同的進化分支,但是不同地區(qū)流行的優(yōu)勢型均為ST11型腸炎沙門菌。值得注意的是,分離菌株中共得到12株新型血清型菌株以及30株新型ST型菌株。

3 討論與結論

沙門菌是最重要的人畜共患病原菌,中國 70% 280% 的細菌性食源性疾病是由沙門菌引起的[20],因此研究沙門菌的分子流行病學具有重要的意義。本研究從省8個市規(guī)模化雞養(yǎng)殖場的糞便中進行沙門菌的分離,并對其耐藥基因和毒力基因的流行特征以及遺傳進化關系進行分析,為雞源沙門菌的精準防治提供科學依據。本研究采集的雞糞便樣本中沙門菌的分離率為 16.21% ,這與丁鑫[21的研究結果( 16.10% )一致。Sun等[22]從全國12個省51個養(yǎng)雞場的3566份直腸拭子樣品中分離到323株沙門菌,分離率為 9.8% ,低于本研究結果,這說明采樣地點對菌株分離率有一定的影響。本研究分離得到的266株沙門菌共鑒定出15種血清型及21個ST型,血清型以腸炎、雞白癇為主,這與張純萍等[23]的研究結果一致。序列分型中沙門菌的優(yōu)勢型為ST11,與王小龍等[24的研究結果一致,而近年來新興的血清型ST17印第安納型沙門菌尚未在地區(qū)大規(guī)模流行,這與趙建梅等[25]的研究結果一致。

抗生素的長期濫用導致多種耐藥沙門菌的出現,使得殺菌藥物的選擇更為困難,因此根據藥敏試驗結果合理使用抗菌藥物顯得尤為重要。本研究分離的266株沙門菌對10種常用抗生素的耐藥情況顯示,分離株對氨芐西林耐藥較為嚴重,與韓毅等[26]的研究結果相似,這可能是由于青霉素藥物在養(yǎng)殖業(yè)中使用較多。本研究分離的266株沙門菌中多重耐藥菌比例為 53.38% ,低于遼寧省( 66.0% )[27]、廣東省( 82.61% )[28]、杭州市0 69.03% )[29]的多重耐藥菌比例,說明地區(qū)沙門菌耐藥情況相對上述省、市較輕。喹諾酮藥物具有廣譜的殺菌效果,并且不易產生耐藥性,尤其對于革蘭氏陰性菌的殺菌效果更好。本研究中沙門菌分離株對喹諾酮藥物的耐藥率( 6.39% )較低,因此,禽類養(yǎng)殖生產中,可以將喹諾酮藥物作為防治沙門菌的首選藥物。

沙門菌的耐藥機制與攜帶的耐藥基因有關,本研究從266株沙門菌分離株中檢測到 β -內酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、磺胺類、喹諾酮類、利福平類、磷霉素類、四環(huán)素類、氯霉素類等9類耐藥基因。磺胺類耐藥基因中sul2檢出率最高,為 59.40% ,這與傅宏慶等[30的研究結果一致。266株沙門菌中β -內酰胺類耐藥基因攜帶率為 67.29% ,低于張萍等[31]的研究結果( 85.0% ),這可能是由于采樣地點不同所導致的。266株沙門菌攜帶的四環(huán)素類耐藥基因主要為tetA,攜帶率為 39.10% ,氯霉素類耐藥基因主要為oR,攜帶率為 21.80% ,磷霉素耐藥基因主要為fosA3,攜帶率為 13.16% ,利福平類耐藥基因主要為arr-3,攜帶率為 13.53% ,喹諾酮類耐藥基因主要為oqxA與oqxB,攜帶率分別為 10.53% 和10.15% ,大環(huán)內酯類耐藥基因主要為mphA,攜帶率為 2.26% ,上述結果與分離菌株耐藥情況基本一致,說明可以通過耐藥基因來預測對應的耐藥表型[32]

目前沙門菌中已經發(fā)現24個毒力島相關基因,毒力島分泌系統(tǒng)的進化是沙門菌適應新環(huán)境的關鍵機制之—[3-34]。本研究從 266 株沙門菌中共檢測出3種毒力島,攜帶158種毒力基因。其中,112種毒力基因的檢出率在 95.00% 以上。毒力島基因表達水平的調控相關基因fur、rpos的檢出率為100.00% 。毒力基因 spvB,spvC,spvD 的檢出率為71.80%.72.56%.72.56% ,高于劉芳萍等[35]的檢測結果( 68.20% )。

綜上所述,省雞源沙門菌對氨芐西林和磺胺甲噁唑的耐藥率較高,耐藥基因以 blaTEM-l,tetA 和sul2為主,血清型以腸炎、雞白痢、鼠傷寒和印第安納為主,省各市沙門菌的優(yōu)化分型為ST11。本研究結果為地區(qū)雞源沙門菌的精準防治提供了科學依據。

圖2分離菌株遺傳進化樹 Fig.2Geneticevolutionarytreeofisolated strains

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(責任編輯:石春林)

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