DNA模擬酶便攜式生物傳感器的研制及其對新冠病毒的檢測

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2），通常被稱為新冠病毒，是一種導致呼吸系統(tǒng)疾病（如新型冠狀病毒肺炎）的主要病原體[1]。新冠病毒屬于冠狀病毒家族，是一種單鏈RNA病毒，其主要編碼為以下四種結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白（簡稱S蛋白）、膜蛋白（簡稱M蛋白）包膜蛋白（簡稱E蛋白）以及核衣殼蛋白（簡稱N蛋白）[2]。其中，親水性較強的N蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，具有很高的免疫原性，可以誘導有機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其編碼基因具有高度保守性，可作為診斷檢測的良好靶標[3。新冠病毒的快速診斷有助于控制病毒傳播、疫苗開發(fā)以及治療方法的改善，目前檢測新冠病毒的主要方法有核酸檢測法和免疫學檢測法[2-5]。核酸檢測法是對病毒RNA基因組進行檢測，檢測目標常見基因有N基因、E基因和開放閱讀框ORF lab 基因，檢測方法包括實時逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）恒溫擴增實時熒光法、RNA捕獲探針法等;免疫學檢測法主要是檢測體內(nèi)產(chǎn)生的病毒抗原或抗體，如膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光免疫分析法、上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法等。RT-PCR是COVID-19診斷的金標準方法，但通常需要冗長的多步處理、專業(yè)操作和昂貴的基礎(chǔ)設(shè)施。免疫層析分析法和化學發(fā)光免疫分析法在內(nèi)的血清學分析是基于抗原/抗體特異性結(jié)合的分析方法，被認為是RT-PCR的補充。血清學檢測通常具有較高的特異性和靈敏度，但需要在癥狀出現(xiàn)數(shù)天后檢測，且容易受到內(nèi)源性干擾物或非特異性抗體的影響，導致假陽性結(jié)果和延時性[45]。相比于RT-PCR、酶聯(lián)免疫、膠體金等檢測手段，生物傳感器既不需要復雜和昂貴的樣品制備，而且能夠?qū)悠愤M行實時分析。因此，生物傳感器，特別是電化學生物傳感器被認為是檢測病毒核酸或病毒抗原的一個很好的替代方法。

生物傳感器能夠?qū)ι磻?yīng)進行測量，測量的方式為產(chǎn)生與反應(yīng)分析物濃度呈比例關(guān)系的信號，主要由像酶、DNA之類的生物識別分子、傳感器以及處理器構(gòu)成。電化學生物傳感器則是將生物識別分子與分析物之間的生化反應(yīng)通過電流、電壓或電荷轉(zhuǎn)移為可測量信號的設(shè)備[]。例如，王霄等成功制備了一種檢測新冠病毒的GaN傳感器，將新冠病毒S蛋白和有機觸媒層之間通過吸附引起的柵極電位變化轉(zhuǎn)換為流過晶體管的電流大小，進而達到檢測新冠病毒的目的[8]。鳥苷酸-四聯(lián)體脫氧核糖核酸（G4-DNA）是一類富含串聯(lián)重復鳥苷酸（G）的DNA序列，通過其對應(yīng)的G堿基之間的胡斯坦堿基配對方式聚集形成的穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)[9-10]。若氯化血紅素（Hemin）金屬離子與G4 DNA結(jié)合，則會形成具有辣根過氧化物酶（HRP）活性的復合物，即G4-Hemin DNA模擬酶（G4-Hemin DNAzyme）[11]。與天然酶相比，G4-Hemin DNAzyme具備良好的穩(wěn)定性、價格低廉、易于制備和修飾等優(yōu)勢[12]。目前，G4-Hemin DNAzyme作為生物傳感方面的新技術(shù)、新策略，已在檢測金屬離子、ATP、可卡因、特定蛋白、microRNAs等方面開展了系列研究，并在生物傳感領(lǐng)域展示了廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。然而，迄今為止利用G4-Hemin DNAzyme催化過氧化氫產(chǎn)生電化學響應(yīng)，對 SARS-Cov-2的保守n基因進行電化學檢測的研究尚未見報道。

本研究設(shè)計了兩段帶有疏基修飾的包含G-二鏈體（G2）結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸序列（ASO），借助對SARS-Cov-2的n基因片段特異性的識別作用能夠使這兩個序列相互靠近形成G4結(jié)構(gòu);隨后G4結(jié)構(gòu)又可以與He-min相結(jié)合構(gòu)建出G4-HeminDNAzyme;在此基礎(chǔ)上，促使 H₂O₂ 分解，由此產(chǎn)生電化學響應(yīng)，并且使得電化學信號得到有效放大，實現(xiàn)對SARS-Cov-2的電化學檢測。該方法簡便、快速、無需合成納米材料、且無蛋白酶的易變性缺點，有望用于發(fā)展中國家及偏遠地區(qū)SARS-Cov-2的現(xiàn)場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

氯化血紅素、二甲基亞砜、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、殼聚糖購自生工生物工程有限公司（上海），過氧化氫 （H₂O₂） ）、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉等試劑購自上海源葉生物有限公司。實驗過程用水均為Milli-Q過濾系統(tǒng)（Millipore，美國）處理的超純水（ （18.25MΩ?cm） 。如未特殊說明，所用試劑均為分析純，且未經(jīng)過進一步純化處理。整個實驗用水全部是由Milli-Q過濾系統(tǒng)處理得到的超純水，其電阻率為 18.25MΩ?cm 。實驗中所用試劑皆為分析級，并且沒有經(jīng)過進一步的純化處理。

1.2 ASO序列設(shè)計

基于新冠病毒SARS-CoV-2保守的n基因，選取兩段寡核苷酸序列用作目標檢測序列，具體為：序列1為5^′ -ACA CCA AAA GAU CAC AUU GG-3'，序列2為5'-CCC GCA AUC CUG CUA ACA AU-3'。以所選定的這兩段目標序列為基礎(chǔ)，設(shè)計并合成與之對應(yīng)的兩段含有G2序列的硫醇修飾的反義寡核苷酸（ASO）序列，其中ASO1的序列為 5^′ -GAT GGG ATG GGA TGGGTG ATT TGTTACCATTTCTCC AAT GTG ATC TTT TGGTGT-SH-3'，ASO2的序列為5'-SH-ATT GTT AGC AGG ATT GCG GGT TGT GTT CTC CTT TCA TGG G-3';將這兩段ASO序列及新冠病毒n基因序列均交于上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，純化方式為高效液相色譜，純度為色譜級。

1.3 G4-HeminDNAzyme的制備

G4-HeminDNAzyme標準制備體系為：將含有 0.5nMASO₁，0.5nMASO₂ 及50copies 'μL SARS-CoV-2保守n基因片段的DNA混合液在室溫下孵育 30min ，制備G4母液；隨后，把G4溶液與濃度為 1nM 的Hemin進行攪拌混勻，在室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng) 30min ，制備G4-HeminDNAzyme。同時，為了獲得最優(yōu)的G4-HeminDNAzyme制備體系，對包括ASO濃度、Hemin濃度、不同 pH 及 H₂O₂ 濃度在內(nèi)的制備條件及電化學響應(yīng)體系進行優(yōu)化。

1.4便攜式集成電化學傳感器的制備流程

所采用的是集成絲網(wǎng)印刷電極，在這種電極中，工作電極、參比電極以及對電極均集成于聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜之上。在使用該電極之前，需先將其放置在pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中浸泡 15min ，以此來激活電極。之后，把 50μL 的G4-HeminDNAzyme滴加到絲網(wǎng)印刷電極表面，然后在室溫條件下使其自然干燥。待干燥完成后，再滴加濃度為 3% 的殼聚糖溶液進行封裝處理，如此便制成了便攜式微型電化學傳感器。

1.5 SARS-CoV-2檢測的可行性驗證

為驗證DNA酶電化學傳感器用于新冠病毒檢測的可行性，本研究設(shè)計四組實驗：取4支離心管分別編號1-4，向1號管加入 10μL 5nMASO，2號管加入 copies μL n基因，3號管加入 號管加入 n基因及 Hemin;再向各管加入HEPES緩沖液（25mMHEPES 200mMNaCl，25mMKCl） 至終體積 100μL ，混勻后室溫孵育 30min ；取 50μL 混合液滴加到絲網(wǎng)電極上（除滴加溶液不同外，其余電化學傳感器的制備步驟與實驗步驟1.4一致），將電極置于含 1μMH₂O₂ 的電解液中檢測，采用循環(huán)伏安法（CV），電位范圍為- .0.4V 至 0.6V ，掃描速度 0.05V/s ，采樣間隔 0.001V ；每組實驗獨立重復三次以確保結(jié)果可靠性。

1.6 SARS-CoV-2的n基因檢測

為考察電化學傳感器對n基因的實際檢測水平，設(shè)立9個實驗組，用以研究ASO序列針對不同拷貝數(shù)的n基因所產(chǎn)生的響應(yīng)情況。按照實驗步驟1.3的相關(guān)要求，把不同拷貝數(shù)的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的n基因，具體包括0copy/μL、5copies μL 、10copies 'μL 、20copies ^′μL 、30copies 'μL 、40copies 'μL 、50copies /μL 、75copies/ μL 、100 copies /μL ，分別與ASO以及Hemin進行混合，制備G4-HeminDNAzyme;接著按照步驟1.4來制備電化學傳感器，室溫環(huán)境中進行孵育和干燥處理。把制備完成的電極放置于前面提到的含有不同H₂O₂ 濃度的電解液里檢測。檢測運用的是CV法，電位范圍為 .0.4V 至 0.6V ，實驗獨立重復操作三次。實驗完成后取-0.4V處的電流值用于繪制電流散點圖并做線性擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1便攜式集成電化學傳感器的制備

首先，將工作電極和參比電極以及對電極全部集成于聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜之上；活化后再將G4-HeminDNAzyme滴加于工作電極表面并室溫干燥；為進一步封裝和保護滴加的DNA辣根過氧化物模擬酶，在其上滴加 3% 殼聚糖，即得便攜式電化學傳感器（圖1）。由此可見，該電化學傳感器制備方法簡單，微型易攜帶，是一種理想的現(xiàn)場檢測工具。

2.2 新冠病毒檢測可行性分析

為了確認本研究設(shè)計的電化學傳感器檢測新冠病毒的方法是否可行，設(shè)計了四組不同的實驗反應(yīng)體系進行分析，使用循環(huán)伏安法檢測電流，檢測范圍為 .0.4～0.6V 。當體系里只有ASO或者只有n基因時，循環(huán)伏安曲線（1和2）均未出現(xiàn)電流峰的變化（圖2A），溶液為無色（圖2B）;當體系中僅存在Hemin時，存在微弱電流變化（曲線3）（圖2A）;當體系中的ASO、n基因及Hemin同時存在時，電流明顯增強（曲線4）（圖2A），反應(yīng)液顏色變化明顯，為藍色（圖2B）。這是因為ASO在n基因存在的條件下可形成G4結(jié)構(gòu)，繼而在Hemin的作用下，形成具有辣根過氧化物酶活性的G4-HeminDNA模擬酶。該模擬酶可模擬HRP對 H₂O₂ 的催化作用，促使其發(fā)生氧化還原反應(yīng)，由此產(chǎn)生電流變化。這表明該G4-He-minDNAzyme電化學傳感器用于新冠病毒檢測具備可行性。

2.3電化學傳感體系檢測條件的優(yōu)化

為了建構(gòu)性能最優(yōu)的基于G4-He-minDNAzyme的電化學傳感器，本研究對一系列可能影響傳感器性能的因素展開了深入探究，具體包括ASO濃度（0.1 ）、Hemin濃度1 （0.1nM，0.3nM，0.5nM，0.75nM，1.0 nM，1.5nM，2.0nM，3.0nM ）、 H₂O₂ 濃度（ 0.05μM，0.1μM，0.5μM，1.0μM，1.5 μM，2.0μM，3.0μM） 以及不同 pH 值（6.0，6.5，7.0，7.4，8.0） 對G4-HeminDNA模擬酶電化學傳感器響應(yīng)所產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果如圖3A所示，在ASO特定濃度范圍（ （0.1-0.5nM） 內(nèi)，隨著濃度的升高，電流呈現(xiàn)出大幅度增強的趨勢；而當ASO濃度進一步增加（ （0.5～1.5 nM）時，電流雖仍然表現(xiàn)為增強態(tài)勢，不過其增強的趨勢已趨于平緩。當Hemin濃度在 0～1nM 之間時，電流明顯增強，

伴隨Hemin濃度的持續(xù)增加（ 1～3nM ），電流雖有增強但其增加趨勢趨于平緩（圖3B）；在 H₂O₂ 濃度為 0.05～ 1.0μM 時，電流表現(xiàn)出大幅度的增強，當 H₂O₂ 濃度繼續(xù)升高至 1.5-3.0μM 區(qū)間后，電流依舊有所增強，不過其增強趨勢漸趨平緩（圖3C）;當HEPES緩沖液pH為7.4時，G4-HeminDNA模擬酶電化學傳感器的電流最強（圖3D）。因此，本研究選定 0.5nMASO，1nMHemin，1.0μMH₂O₂I 以及 pH7.4 作為該G4-Hemin DNAzyme電化學傳感器檢測SRAS-CoV-2的最優(yōu)條件。

2.4新冠病毒n基因的電化學檢測

為探究所制備的便攜式微型電化學傳感器對SRASCoV-2的n基因?qū)嶋H檢測水平，本研究設(shè)置了9個實驗組，以檢測ASO序列針對不同濃度n基因的響應(yīng)特性。由圖4A和圖4B可知，電化學傳感器的響應(yīng)電流與病毒n基因濃度之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，即隨著n基因濃度的增加，電流值亦隨之增大。從圖4C的線性擬合圖中可進一步得出其線性擬合方程為y=-3.12x-17.25（ R²=0.99 ），其中x表示n基因濃度，y表示電流。在n基因濃度為5-50copies ?μL 的低濃度區(qū)間內(nèi)，該線性擬合具有良好的擬合效果。當n基因濃度處于較高范圍（75-100copies /μL ）時，CV法檢測表明會出現(xiàn)強于50copies/uLn基因濃度所對應(yīng)的電流。因此，該便攜式微型的電化學傳感器對新冠病毒n基因的檢測限為5＼～100copies /μL ，另外按照 3σ/S 原則分析，當信號比等于3時，相應(yīng)的檢測限可確定為1.12copies μL ，其中σ代表空白信號標準偏差，S表示線性擬合曲線斜率。基于此，G4-HeminDNA模擬酶電化學傳感器在對新冠病毒n基因進行檢測時，展現(xiàn)出快速響應(yīng)和高靈敏度的優(yōu)勢。

3 討論

電化學生物傳感器是將生物識別分子與分析物之間的生化反應(yīng)通過電流、電壓或電荷轉(zhuǎn)移等方式轉(zhuǎn)化為可測量信號的設(shè)備[7]。Hemin本身具有低的過氧化物酶活性，而G四鏈體構(gòu)成的平面能與Hemin之間通過π-π 堆疊作用緊密結(jié)合以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生增強的類過氧化物酶活性[11-12]。本研究利用靶向n基因的ASO序列與hemin在新冠病毒存在條件下，形成具過辣根氧化物酶活性的G4-HeminDNAzyme，該酶可催化底物過氧化氫產(chǎn)生放大的電化學響應(yīng)。因此，在電化學傳感器的可行性驗證中僅Hemin存在時有微弱電流的出現(xiàn)，在ASO和n基因同時存在的條件下由于G4-Hemin DNAzyme的生成，催化底物過氧化氫產(chǎn)生放大的電化學信號，電流明顯增強。G4基本結(jié)構(gòu)單元為具中央空腔的G-四分體片層，其中一價的陽離子可通過占據(jù)G4-DNA中心空腔以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)[1415]。為使得到的G4結(jié)構(gòu)處于穩(wěn)定狀態(tài)，實驗中所用HEPES緩沖液均包含有 25mM 的 K⁺ ；另外，實驗過程中與DNA混合溶液及檢測溶液均選用HEPES緩沖溶液，這是一種由4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制的氫離子緩沖劑，對細胞無毒性作用，且能較長時間控制恒定的pH范圍。

SARS-CoV-2感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病對全球公眾健康造成巨大威脅，鑒于其高傳染性，該病毒檢測方式的精準性和靈敏性在疫情監(jiān)控和疾病診療方面尤其重要。在這場抗疫阻擊戰(zhàn)中，SARS-CoV-2的核酸檢測成為了疫情排查和疾病診療的重要方式。本研究所制備的便攜式微型電化學傳感器的電化學響應(yīng)范圍為5＼～50copies μL ，檢測限低，為1.12copies/μL。目前，我國市售的核酸檢測試劑盒檢測限一般為500 copies/mL左右[6-18];國際上Leila利用電化學生物傳感器對SARS-CoV-2的S及Orflab基因的檢測限分別為2 copies 'μL 和3copies/ μL^[19] ;Chaibun采用快速電化學檢測法實現(xiàn)對SARS-CoV-2的s和n基因的檢測，檢測限均為1copy ρ_⊥L^[20] （表1）。因此，本研究所制備的便攜式微型電化學傳感器可與國內(nèi)已批準上市的核酸檢測試劑盒及國外研究結(jié)果相媲美，可望為新冠病毒快速、現(xiàn)場、靈敏檢測提供新的替代方案。

4結(jié)論

綜上，本文搭建了一種基于G4-HeminDNA模擬酶的微型便攜式電化學生物傳感器，并證明其具有快速、靈敏檢測新冠病毒的能力。該此方法是通過兩段首尾富含G且經(jīng)過硫醇修飾的ASO序列實現(xiàn)介導作用的，其能夠與新冠病毒中保守的n基因進行雜交最終形成G4結(jié)構(gòu);在Hemin和 K⁺ 存在條件下生成具辣根過氧化物酶活性的G4-HeminDNAzyme;將該模擬酶修飾在集成式微型電極表面氧化 H₂O₂ 產(chǎn)生有效放大的電化學信號;制備的便攜式電極在對新冠病毒n基因檢測時顯示了高靈敏性，檢測限可達1.12copies/uL。因此，本研究開發(fā)的便攜式生物傳感器能夠克服現(xiàn)有新冠病毒檢測的復雜性以及成本高、耗時長的問題，可實現(xiàn)高靈敏、快捷、現(xiàn)場檢測新冠病毒，有望用于發(fā)展中國家及偏遠地區(qū)SARS-Cov-2的現(xiàn)場快速檢測。

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Development of a Portable Biosensor Based on DNAzyme and Its Efficient Detection of Novel Coronavirus

LIQuan-fal，WANGHao-yu2，F(xiàn)ANGDa-wei2，GU Tao2 （1.Collegeofifeis，niNalUvesityuuin；oliatedtalUiveitWu 241001，China）

Abstract：Respiratory disease caused by a Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 （SARS-CoV-2） poses amajor threat to global public health，whose rapid diagnosis has contributed to the control of virus spread， vaccine development，and improvements intherapeutic approaches.Herein，two stretches ofantisense oligonucleotide sequences with guanine （G）-rich at both tail ends were synthesized manually based on a conserved n gene of SARS-CoV-2，which could be hybridized with the target DNA （the n gene of SARS-CoV-2） to assemble into a G4 structure.Subsequently，G4-Hemin DNA mimetic enzyme （G4-Hemin DNAzyme）with a horseradish peroxidase active can be generated in the presence of Hemin and K⁺ .The integrated micro-electrode modified by the mimetic enzyme can oxidize H₂O₂ to produce electrochemical signals and be effectively amplified，realizing sensitive detection of novel coronavirus with a limit of detection of 1.12 copies ^′μL . Therefore，the portable micro-electrochemical sensor developed in this study based on G4-Hemin DNAzyme has an efficientand sensitive electrochemical response to SARS-CoV-2，which canrealize highly sensitive，fast and on-site detectionofnovel coronavirus.

Key words： novel coronavirus； G-quadruplexes； antisense oligonucleotide sequences；DNAzyme（責任

（責任編輯：張小俊）