鹽脅迫對大豆苗期根系的影響及GWAS分析

中圖分類號：S565.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）03-0627-17

0 引言

【研究意義】大豆是我國重要的糧食作物之一，且高蛋白、低脂肪[1]，鹽脅迫對大豆幼苗根系的生長呈顯著的抑制作用，大豆幼苗根系的生長與大豆耐鹽性密切相關。在鹽脅迫下，大豆的百粒重、單株粒重、生育期和收獲指數等均會受到不同程度的影響[2-3]。有研究認為，土壤中存在的NaCl是土壤鹽漬化的主要原因[4]。大豆的生理生化活動和生長發育受土壤鹽漬化的顯著影響，并直接決定了大豆的產量和品質[5-6]。因此，篩選耐鹽大豆種質資源并找到與耐鹽有關的位點，對大豆在鹽堿地中的改良具有重要意義。【前人研究進展】大豆在不同生長發育階段，如萌發期、苗期、花期和成熟期均會表現出不同程度的耐鹽抗性，且不同發育階段的耐鹽性無明顯的相關性[7-8]，大豆苗期是作物在鹽漬化土壤發育時對鹽較敏感時期，解決了大豆苗期耐鹽的問題，作物將會有良好的生長發育。孔令功鑒定出10份高度耐鹽的品種、10份中等耐鹽的品種以及2份對鹽敏感的品種。韓岱等[1°對60份大豆種質進行苗期耐鹽篩選，共選育出12份耐鹽品種、24份中等耐鹽品種、16份敏感品種和8份不耐鹽品種。張兆寧等[1]以62份大豆品種為材料，在萌發期進行鹽脅迫處理，篩選出7份耐鹽品種、12份較耐鹽品種。曹帥等采用水培法對18份大豆耐鹽堿品種進行鑒定，共鑒定出4份耐鹽堿品種。大豆根系是大豆與土壤環境直接交流的器官，長時間在鹽土壤或堿性土壤的環境中，由于離子毒害的影響，細胞膜會遭受破壞進而影響大豆對水分和營養物質的吸收，同時內源激素合成紊亂，根部失去生長活力后導致地上部葉片逐漸死亡[13]。大豆根系是遺傳和環境因素相互作用的結果，根系吸收養分的強度可以通過根長等指標體現[14]。鹽生植物在低濃度的鹽脅迫下表現出一定的適應性，在這種環境下，根系的長度、表面積以及體積均有不同程度的增長。然而，當鹽脅迫濃度顯著升高時，植物根系生長會受到顯著的抑制作用[15]。【本研究切入點】目前對大豆耐鹽性的研究大多集中在萌發階段，而在苗期篩選耐鹽大豆種質資源的相關報道較少，不同作物類型會因為受到鹽脅迫而呈不同的表型變化。對水稻萌發期進行深入研究的結果顯示，鹽脅迫下，水稻的根總數量明顯減少，并且隨著鹽濃度的增高根的數量受抑制越發明顯，總根長也受到了明顯的抑制，甚至最終根系完全死亡，停止生長[16]。在鹽脅迫下小麥的根系生長也受到明顯的抑制，總根長較對照相比呈顯著的抑制，但根表面積和體積變大[17]。研究發現，棉花的根長也會因為鹽脅迫而受到顯著的抑制作用[18]。說明大多作物均會因為受到鹽脅迫而抑制根部生長。需研究采用盆栽法對大豆苗期進行耐鹽性篩選，尤其是對大豆根系進行表型指標測定，并利用所測得的根系表型指標對大豆耐鹽性進行綜合評價。【擬解決的關鍵問題】以301份大豆種質構成的自然群體為材料，使用盆栽法進行鹽脅迫處理，通過對大豆苗期根系的篩選與鑒定，篩選出優異大豆種質資源并找到與耐鹽有關的位點，為耐鹽大豆新品種培育、產量和質量提高奠定基礎。

材料與方法

1.1 材料

選取301份大豆種質構成的自然群體為試驗材料，品種類型主要來源于黑龍江省、吉林省、遼寧省等省區（市），其中，包含黑龍江省大豆品種118份，吉林省大豆品種130份，遼寧省大豆品種43份，其他省區（市）等大豆品種10份。表1

表1301份大豆供試材料

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

采用人工氣候室對大豆種質進行盆栽蛭石培養 8cm×8cm×8cm） 。培養條件為光照/黑暗時間 16/8h ，溫度為 28^°C/22^°C ，相對濕度 80% 。選取大小均一且飽滿、種臍完整的大豆種子進行篩選。每個品種栽植18盆，每盆播種1粒種子，待萌發7d后成長至VC期時，挑選長勢相同的幼苗進行鹽（ MS+250mmol/LΔNaCl? 脅迫處理，以普通營養液（MS培養基）作為對照，對照和鹽脅迫處理各3盆。一次固定向托盤里面澆灌3LMS溶液，鹽脅迫澆灌 3L 溶液（ MS+250mmol/LΔNaCl? 進行處理，每3d更換1次溶液。7d后將對照和鹽處理溶液中的幼苗全部取回并進行表型觀察統計和耐鹽性狀指標測定。

篩選苗期耐鹽大豆種質資源時，使用已知耐鹽品種東生118和威廉姆斯82進行鹽脅迫處理，分別設置NaCl濃度為 50，100，150，200，250 和300mmol/L共6個鹽濃度梯度進行脅迫處理。

1. 2.2 根系性狀鑒定及數據采集

使用浙江托普云農根系分析儀（GXY-B）測量總根長（Totalrootlength，TRL）根總數量（Totalrootnumber，TRN）、根尖數量（Roottipnumber，RTN），總根長指總的根系長度，包括主根和各級次根，根總數量是各級根的數量總和，根尖數量等于終止連接點的數量。將幼苗從子葉處剪斷使用千分稱稱量根部鮮重（Rootfreshweight，RFW）、根部干重（Rootdryweight，RDW）。

根據正常和鹽脅迫培養條件下的根系各性狀指標計算脅迫指數。

式中， SI 為各性狀指標脅迫指數； X_NaCl 為鹽脅迫培養條件下各性狀指標值； X_CK 為正常培養條件下各性狀指標值。脅迫指數越大，大豆根系受鹽脅迫影響變化越小，脅迫指數越小，大豆根系受鹽脅迫影響變化越大。

1. 2.3 根系性狀全基因組關聯

利用BLINK、GLM、MLMM3種方法對大豆根系性狀的相關表型值進行全基因組關聯分析[19]，以Bonferroni校正顯著性閾值（ P 值），依次繪制曼哈頓圖顯示SNP與大豆根系性狀之間的相關性。

1.3 數據處理

將原始表型數據用MicrosoftExcel2023進行簡單處理，使用IBMSPSSStatistics27進行相關性分析、隸屬函數分析，依據隸屬函數分析得出的D值對大豆種質進行聚類分析，利用CMplotR包繪制曼哈頓圖[20] 。

2 結果與分析

2.1 大豆苗期鹽脅迫篩選體系的建立

研究表明，鹽脅迫7d后，東生118的地上部分和地下部分在50、100、150和 200mmol/L4 種不同的鹽濃度中生長狀態良好，當鹽溶液濃度達到 250mmol/L 時，植株葉片開始明顯變黃，根系生長受到了明顯的抑制，但未出現死亡情況。威廉姆斯82的地上部分和地下部分在50、100mmol/L的鹽溶液中生長時，植株無明顯受害現象，當鹽溶液濃度達到150和 200mmol/L 時，植株葉片明顯變黃，但未完全死亡，當鹽溶液濃度達到 250mmol/L 時，威廉姆斯82的地上部分開始死亡，地下部分也完全喪失活力，植株和根系全部停止生長。在 250mmol/L 的鹽溶液處理7d后，不同的大豆品種之間會出現顯著的差異，250mmol/L的鹽溶液可以作為鹽脅迫的合適濃度。圖1

2.2 鹽脅迫下根系各指標變化值

研究表明，在NaCl脅迫下，與正常培養條件下大豆根系性狀各指標相比，各指標均受到不同抑制，根總數量受抑制最為嚴重，正常培養條件下根總數量均值為2113.15，鹽脅迫條件下根總數量均值為1138.23，與對照相比平均降低了46.13% 。下降幅度最小的指標為根尖數量，正常培養條件下均值為452.69，鹽脅迫條件下均值為356.27，與正常培養條件下相比平均下降21.29% 。所有根系性狀指標脅迫指數的平均值均為負值，鹽脅迫條件下與正常培養條件下相比各個根系性狀指標普遍受到抑制，其中根總數量脅迫指數平均值最小，為－42.8，在鹽脅迫下，根總數量受抑制最為嚴重。而脅迫指數最大的是根尖數量，均值為-14.67，變異系數 -283.37% ，與其他根系性狀指標相比受鹽脅迫影響較小。除此之外，根部鮮重、根部干重和根總長脅迫指數均值均較小，在鹽脅迫培養條件下這幾種根系性狀全部受到明顯抑制。表2

A：東生118在不同鹽濃度下生長的地上部分表型;B：東生118在不同鹽濃度下生長的地下部分表型;C：威廉姆斯82在不同鹽濃度下生長的地上部分表型；D：威廉姆斯82在不同鹽濃度下生長的地下部分表型

2.3 不同條件下大豆根系性狀間的相關性

研究表明，根部鮮重與根部干重、根總數量、根尖數量和根總長均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.714、0.712、0.533和0.740。根部干重與根總數量、根尖數量和根總長均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.4970.255和0.503。根總數量與根尖數量和根總長均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.799、0.980。根尖數量與根總長呈極顯著正相關，相關系數為0.822。表3

根部鮮重與根部干重、根總數量、根尖數量和根總長極顯著正相關，相關系數分別為0.930、0.827、0.746和0.841。根部干重與根總數量、根尖數量和根總長極顯著正相關，相關系數分別為0.791、0.706和0.794。根總數量與根尖數量、根總長極顯著正相關，相關系數分別為0.914、0.970。根尖數量與根總長極顯著正相關，相關表系數為0.890。表4

根部鮮重與根部干重、根總數量、根尖數量和根總長極顯著正相關，相關系數分別為0.860、0.7710.663和0.758。根部干重與根總數量、根尖數量、根總長極顯著正相關，相關系數分別為0.760、0.617和0.748。根總數量與根尖數量、根總長極顯著正相關，相關系數分別為0.892、0.974。根尖數量與根總長極顯著正相關，相關表系數為0.874。大豆根部在非脅迫、NaCl脅迫條件下，大豆根系各性狀指標之間均呈極顯著正相關。表5

2.4 大豆根系耐鹽性的主成分

研究表明，在累計貢獻率達到 93.938% 時，有2個主成分因子，而前2個主成分的各自貢獻率分別為 51.775% 42.162% 。根總數量、根尖數量以及根總長均與較高的因子載荷密切相關，分別為 0.859，0.929 和0.845，作為第1主成分綜合為根系生長因子。根部鮮重和根部干重在第2主成分中具有較高的因子載荷，分別為0.863和0.907，可以綜合為生物量因子。表6

2.5 隸屬函數分析評價大豆幼苗根系耐鹽性

研究表明，排名前10的耐鹽性材料編號分別為GWS025（合豐17）GWS184（白露豆）、GW229（蛟河小粒黃）、GW130（鐵莢）、GW218（延農5號）、GW287（丹東金黃豆）、GW133（274-2）、GW136（大金黃）、GW72（小金黃1號）、GW285（吉青1號）。排名后10的耐鹽性材料編號分別為69（中勝1號）、GW76（國育B5）GW67（九農9號）、GW77（國育98）、GW103（小黃殼）、GW78（哈1號）GW30（綏農1號）、GW1（黑農18）、GW208（吉林18號）、GW165（嫩豐11號）。表7

2.6 不同大豆品種根系耐鹽性綜合評價

研究表明，第1類群包含編號GW25（合豐17）、GW184（白露豆）、GW229（蛟河小粒黃）、GW130（鐵莢）等4份大豆品種，為強耐鹽品種，占供試材料的 1% ；第2類群包含編號為226（九臺無限白花）、GW248（通化平頂黃）、GW58（吉林10號）等73份大豆品種，為耐鹽品種，占供試材料的的 24% ；第3類群包含編號為274（綏農8號）、GW256（安圖黑豆）GW260（九臺豬眼豆）等137份大豆品種，為中等耐鹽品種，占供試材料的46% ；第4類群包含編號為206（樺甸四粒黃）、GW54（吉林3號）GW167（北豐1號）等87份大豆品種，為敏鹽品種，占供試材料的 29% 。圖2

2.7 大豆根系性狀各指標的GWAS分析

研究表明，正常培養條件下，地下部鮮重、根總長和根總數量共檢測到2個不同的顯著SNP位點。在鹽脅迫條件下，根總數量和根尖數量共檢測到7個不同的可能與大豆根系耐鹽性狀相關聯的SNP位點。

在正常培養條件下，利用GLM和BLINK方法在地下部鮮重、根總長、根總數量各檢測出1個SNP位點，分別分布在1號染色體上和4號染色體上，其中根總長和根總數量定位到同一個SNP位點，分布在1號染色體上。在鹽脅迫處理后，利用GLM和BLINK方法在根尖數量共檢測出9個SNP位點，分別分布在36、8號染色體上，其中有2個相同的位點由GLM和BLINK方法同時檢測出，分布在6號染色體和8號染色體上。利用MLMM方法檢測出1個與根總數量相關聯的SNP位點，其中根總數量和根尖數量定位到同一個SNP位點，位于6號染色體上。表8，圖3

3討論

3.1 鹽脅迫下大豆苗期表型變異

在鹽脅迫的環境下，大豆的各項表型指標均受到了不同程度的抑制。根據姜靜涵[21]研究顯示，不耐鹽的品種在鹽脅迫下會出現枯萎死亡的狀況，說明地上部分的表型與大豆耐鹽性密切相關。根據牛遠等[22研究指出，大豆在鹽脅迫環境下，根部干重、鮮重、長度和數量均會受到顯著抑

A：正常培養條件下根部鮮重的manhattan圖和QQ-plot圖;B：正常培養條件下根總長的manhattan圖和 QQ-plot 圖；C：正常培養條件下根總數量的manhattn 圖和QQ-plot圖;D：NaCl脅迫下根總數量的manhattn圖和QQ-plot圖;E：NaCl脅迫下根尖數量的 manhat-tan圖和QQ-plot 圖（BLINK模型）;F：NaCI脅迫下根尖數量的 manhattan圖和QQ-plot 圖（GLM模型）

制。與試驗研究結果一致，進一步證實了這些指標是鑒定耐鹽大豆品種的關鍵因素。周秀文等[23研究發現，在不同鹽濃度環境下生長的大豆品種，地上部表型與地下部表型均表現出顯著性差異，在同種鹽濃度生長的條件下，不同品種之間也存在差異，受到鹽脅迫時大部分大豆品種的地下部干重和地下部鮮重均受到了顯著的抑制。在試驗研究中，觀察了大豆幼苗在鹽脅迫下和正常培養條件下的生長情況。結果顯示，受鹽脅迫的大豆地下部干重、鮮重、根長以及根的數量均有所下降，表明大豆耐鹽性的強弱可以用大豆根系表型區分。

3.2 大豆苗期耐鹽性綜合評價方法

在作物分類領域，最常見的對抗逆性作物進行分類的分析方法為主成分分析法和聚類分析法。孫現軍等[24利用主成分分析法，通過分析主成分的貢獻率以及運用隸屬函數進行綜合評價得到 D 值，根據 D 值通過聚類分析最終將耐鹽小麥種質資源劃分為5個不同的耐鹽級別。張翠平等[25]通過聚類分析法，從18份大豆品種中選育出耐鹽品種5份和鹽敏感品種2份。張海平等[26]通過隸屬函數分析法，對568份大豆種質資源進行了抗旱評級，最終確定了4份耐旱種質和242 份敏感型種質。林文磊等[2在對7個農藝性狀進行主成分分析后，獲得了2個主成分因子。唐麗敏等[28]也通過類似方法，通過主成分分析對9個農藝性狀進行分類為3個主成分因子。這些研究結果顯示，隸屬函數分析法、主成分分析法和聚類分析法在大豆耐鹽評級分類中展現出了極高的準確性和可行性，這些方法不僅適用于大豆，而且在玉米[29]、苜蓿[30]、小麥[31]等作物中也得到了廣泛應用。試驗研究通過這些方法最終篩選出編號為25（合豐17）、184（白露豆）等4份強耐鹽大豆品種。

3.3 全基因組關聯分析

全基因組關聯分析在大豆中大多應用在耐鹽堿、抗倒伏、單株產量、株高、葉綠素含量等相關性狀。滕衛麗等[20]用255份大豆種質材料對大豆芽期和苗期進行耐堿性篩選，并結合芽期和苗期的耐堿性指標進行GWAS分析，共關聯到64個SNP位點并篩選到26個候選基因。張新草[用281份大豆種質材料對發芽期的大豆進行耐鹽堿性鑒定，并結合所測得的相對發芽率、相對根長等8個性狀指標進行全基因組關聯分析，8個性狀最終關聯到268個SNP位點。李文濱等[33以150份大豆種質資源在收獲期測定抗倒伏的相關性狀，用GWAS分析最終篩選出3個可能與大豆抗倒伏相關的基因。梁騰月[34對大豆蛋白質含量進行GWAS分析，鑒定出48個與大豆籽粒蛋白含量相關的SNP位點，對大豆脂肪含量進行GWAS分析，鑒定出39個與大豆籽粒脂肪含量相關的SNP位點，對大豆耐低磷性進行GWAS分析，鑒定出32個與大豆耐低磷性相關的SNP位點。Kan等[35]用相對發芽率作為評定大豆耐鹽性的重要指標，通過全基因組關聯分析鑒定到8個與大豆耐鹽性相關的顯著SNP位點。Do等[36]通過對305份大豆種質的耐鹽性鑒定并進行了全基因組關聯分析，在大豆的3號染色體、1號染色體、8號染色體上均鑒定出與大豆耐鹽性顯著關聯的SNP位點。大豆根系各性狀全基因組關聯分析結果顯示，與之關聯的顯著SNP位點廣泛存在于大豆基因組中，該染色體上可能存在與大豆耐鹽相關的基因。

4結論

301份耐鹽大豆品種分為4類：4份強耐鹽品種為第1類，73份耐鹽品種為第2類，137份中等耐鹽品種為第3類，87份鹽敏感品種為第4類。利用BLINK、GLM、MLMM3種方法共檢測到9個可能與大豆根系耐鹽性狀相關聯的顯著SNP位點。大豆根系表型指標與大豆耐鹽性密切相關。

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Abstract：【Objective】So in view of this，our project aims to explore excellent salt tolerant soybean germplasm resources and identify stable expresson sites related to salt tolerance.【Methods】In this study， 250 mmol/L NaCl solution was used to simulate the saline-stressed growth environment，and treat 301 soybean seedlings.7 days later，five traits including total number of roots，number of rot tips，total length of roots，root fresh weight，root dry weight were measured and then salt tolerance of soybean seedling was evaluated byprincipal component analysis（PCA），membership function analysis，and cluster analysis basedon stress indices of various indicators，and finally，genome-wide association analysis（GWAS）was conducted based the root trait value under different treatment conditions.【Results】According to the strength of salt tolerance，the 3O1 materials could be divided into 4 categories.4 strong salt tolerant varieties were classified as the first category，73 salt tolerant varieties classified as the second category，137 moderate salt tolerant varieties classified as the third category，and 87salt sensitive varieties classified as the fourth category. GWAS showed that under normal treatment，twosignificant SNP loci were detected in root fresh weight，total root length，and total root number.A total of7SNP loci that might be associated with salt tolerance traits in soybean rots were detected under salt stress conditions，including the total number of roots and the number of root tips.【Conclusion】The phenotype of soybean root system is closely related to soybean salt tolerance，and screening sites related to salt tolerance through GWAS provides efective basis for the cultivation of new salt tolerant soybean varieties.A total of9 significant SNP loci possibly related to salt tolerance traits in soybean roots were detected.

Key words：soybean;root;salt tolerance；membership function;GWAS