Cu2+ 、 Zn2+ 固載硅膠整體柱對8-羥基 -2′ -脫氧鳥苷固相微萃取性能研究

8-羥基 -2^′ -脫氧鳥苷（8-OHdG），是生物體內DNA分子的鳥嘌呤第8個碳原子被過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基等活性氧氧化損傷后形成的產物，常被認為是DNA氧化損傷的生物標志物[1-2].據研究報道[3-4]，生物體內8-OHdG 的濃度水平與DNA 鳥嘌呤分子的損傷程度相關，同時，基因突變、致癌、衰老等過程均由損傷的DNA分子引起，因此8-OHdG通常用作評價環境污染、退行性病變、衰老和癌癥等的相關標志物.準確、靈敏、快速檢測人體尿液中8-OHdG 的含量對監測人體健康狀況具有重要意義.

目前，常用的檢測尿液中 8-OHdG 的方法有酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[5]、高效液相色譜電化學檢測（high performance liquid chromatography electro-chemical detectors，HPLC-ECD）[6-7]、高效液相色譜紫外檢測（high performance liquid chromatography ultraviolet detectors，HPLC-UV）[8]和液相色譜質譜聯用（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）[9-1]等方法，其中HPLC-UV檢測方法因其具有快速、操作簡單、成本低等優勢，被廣泛應用于DNA氧化損傷標志物 8-OHdG的定量檢測.為了提高檢測結果的準確性和靈敏度，在實際樣品前處理過程中，常利用固相萃取（SPE）或固相微萃取（SPME）減小基質影響同時提升分析對象濃度[12-13].例如：聚苯乙烯/二乙烯苯/陽離子交換 SPE小柱被用來凈化和萃取富集尿樣中的8-OHdG，結合UPLC-MS-MS，所建立的分析方法檢出限低至 0.15μg/L ，具有較高的靈敏度[14].8-OHdG分子印跡整體柱作為 SPME 介質，因其具有高效的富集效率和選擇性，用于尿樣中分析對象的有效提取，結合 HPLC-UV，可以實現對實際樣品中痕量8-OHdG 的有效檢測，檢出限為 2.04nmol?L^-1[15] .近年來，不斷開發具有高效富集效果的 SPE 材料是提高分析檢測靈敏度的研究熱點之一.

金屬離子固載有機配體材料因其能夠為有機分子中特定官能團提供配位作用，表現出良好的萃取性能，已被用作 SPE介質從復雜基質中富集和提取目標分析物[16-18].同時，將該材料與其他基質復合是增強兩種材料潛在優勢的有效途徑之一.例如，聚丙烯腈復合 K⁺-γ- 環糊精金屬-有機雜化納米纖維、聚離子液體 ② Zr⁴⁺ -咪唑整體柱、 Fe³⁺ 固載對苯二甲酸功能化 Fe₃O₄ 核殼雜化材料和金屬-有機骨架/殼聚糖復合材料，均被用作富集復雜樣品基質中痕量目標分析對象[19-22].迄今為止，金屬離子與殼聚糖等天然多糖配位形成的金屬離子固載有機聚合物材料在SPE相關領域的研究應用鮮有報道.

本研究利用簡便的溶膠-凝膠法，通過自組裝過程，以降解殼聚糖為配體，制備了 Cu²⁺ 固載硅膠整體柱和 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱，進一步研究該材料對8-OHdG的萃取性能，探索有效提取復雜樣品中8-OHdG 的SPE方法，利用該材料高效的富集效果，結合HPLC-UV，建立一種靈敏、高效、實用的定量分析方法.

實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC2000 液相色譜儀（上海天美科學儀器有限公司）;HSC-12B氮吹儀（天津恒高電氣科技有限公司）；LSP04-1A注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；石英毛細管 （0.32mm i.d.，河北永年光纖維廠）；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，美國ThermoFisher公司）； SU8000 型掃描電子顯微鏡（SEM，日立高新技術公司）和X射線能譜元素分析儀（EDS，日立高新技術公司）.

8-OHdG、萊克多巴胺、雙酚A、芘標準品（Sigma 公司，St.Louis.Model，USA）;殼聚糖、冰乙酸、氨水、過氧化氫（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）;硫酸銅、尿素、乙酸鋅、亞氨基二乙酸（分析純，天津市德恩化學試劑有限公司）;聚乙二醇（分析純，阿拉丁試劑有限公司）；四甲基氧硅烷（ 98% ，武漢大學有機硅新材料有限公司）;實驗用水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）.

標準儲備液的配制：準確稱取 1.000 0mg 8-OHdG 標準樣品，用甲醇溶解，配制成 0.035 3mmol/L 的標準儲備液，儲存于冰箱中 4^°C 保存，使用時用乙腈稀釋，配制成系列8-OHdG標準工作液.

1.2 實驗過程

1.2.1 金屬離子固載硅膠整體柱的制備

截取一定長度的石英毛細管，先用純凈水洗凈，注入 1mol/LNaOH 溶液，于 40°C 下保持 12h ，然后用1mol/L HCl溶液將毛細管沖洗 40min 后，用純凈水以 0.1mL/min 的流速清洗至中性，于 120^°C 下氮吹烘干 5h 后，硅膠墊封口，保存備用.

準確稱取亞氨基二乙酸 2.0g 、殼聚糖 2.0g 至 250mL 圓底燒瓶中，加入 80mL 純凈水，于 50^°C 下攪拌^2h 后，加入 2.4mL3% （質量分數）過氧化氫溶液，繼續攪拌 3h ，制得降解殼聚糖溶液，冷卻至室溫后備用.

分別稱取 0.020gCuSO₄?0.023gZn（AC）₂ 于兩個 10mL 離心管中，加入 4mL 降解殼聚糖溶液，常溫下攪拌約 10min 后；分別加入 0.22g 尿素 .0.20g 聚乙二醇，冰水浴條件下攪拌約 10min 后加入 1.4mL 四甲氧基硅烷，磁力攪拌 3h ，然后用氨水調節混合溶液的 pH 至7.0，超聲脫氣，制得均一溶膠，將其注入已處理的毛細管中，用硅膠墊將毛細管兩端封口，于 40°C 下反應 20h ，然后在 90°C 下反應 ^7h 制備的整體柱依次用甲醇和丙酮洗滌，然后將整體柱放置于室溫下干燥后備用.

1.2.2 固相微萃取（SPME）過程

將制備的 Zn²⁺ 、 Cu²⁺ 固載整體柱連接在注射器前端，首先用 1mL 甲醇溶液平衡整體柱 2min ；將2.5mL 8–OHdG 標準溶液以 50μL?min^-1 流速通過整體柱;經過空氣吹干后，用 1mL 甲醇/氨水 （9/1，V/ V 以 30μL?min^-1 流速洗脫整體柱，收集前 37.5μL 洗脫液，氮氣吹干后，殘留物用 50μL 純凈水溶解后，進行 HPLC分析，以此考察整體柱的富集效果.每個實驗在相同條件下重復3次.

1.2.3 實際樣品處理

收集的 10mL 晨尿樣品存于離心管中，冷凍儲藏.在室溫下解凍后于 4000r?min^-1 下離心 30min ，取上清液至圓底燒瓶中，在 55°C 下減壓蒸干，再加入 10mL 甲醇超聲溶解，離心 10min 后取上清液旋蒸至干，然后再加入 10mL 乙腈，超聲溶解，并離心 10min ，取上清液備用.

1.2.4 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱 （4.6mm×250mm，5μm） ；紫外檢測波長為 254nm ;流動相組成為甲醇/ 0.1% （質量分數）乙酸 （V/V=1/9 ）；流速為 1.0mL/min ;進樣量 20μL ;柱溫為 40°C ：

2 結果與討論

本研究采用富集倍數（enrichmentfactor，EF，簡記為 E_F ）作為評價依據，衡量整體柱對8-OHdG的富集效率 .E_F 的定義如下：

式中， C₀ 是指萃取前溶液中8-OHdG的濃度 （nmol?L^-1 ）； C₁ 是指經過整體柱富集后溶液中8-OHdG的濃度 （nmol?L^-1; ）

2.1 整體柱的制備條件優化及表征

2.1.1 整體柱制備條件的選擇及優化

為制備具有較高萃取富集性能和良好通透性的 Zn²⁺ 和 Cu²⁺ 固載硅膠整體柱，對溶膠制備過程的 ΔpH 、CuSO₄ 和 Z_n（AC）₂ 用量、降解殼聚糖溶液體積等操作條件進行系統優化.由圖1（a）可知，溶膠-凝膠過程中反應體系的 ΔpH 值對整體柱的萃取性能有一定影響.當 pHgt;7.0 或 pHlt;3.0 時，溶膠體系會迅速凝固，甚至無法形成凝膠.因此實驗探究了反應體系 pH=3.0，5.0 和7.0時整體柱萃取性能.當 pH=7.0 時，所制備硅膠整體柱對8-OHdG萃取性能最佳.實驗對 CuSO₄ 、 .Z_n（AC）₂ 和降解殼聚糖溶液體積添加量進行系列優化，結果見圖1（b，c），所制備整體柱的萃取性能隨 CuSO₄ 小 Z_n（AC）₂ 和降解殼聚糖溶液的遞增，呈現出先增大后減小的趨勢.說明隨著金屬離子和降解殼聚糖的引人，硅膠整體柱材料對8-OHdG有效作用活性位點增多，因此，隨著反應物用量的增加，整體柱的萃取效果得到有效提升.但是過量引入 CuSO₄ 、 Z_n（AC）₂ 和降解殼聚糖，強化了溶膠凝膠過程，使得整體柱更加緊實，通透性降低，對8-OHdG的萃取性能就隨之減小.因此，本實驗制備 Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱的最佳反應條件是采用 pH 為7的溶膠反應體系、分別加入 0.020g （20CuSO₄ 和 0.023gZn（AC）₂ ，以及加入 4.0mL 降解殼聚糖溶液.

2.1.2 整體柱結構和形貌表征

利用傅里葉紅外光譜（FTIR）、掃描電鏡（SEM）和X射線能譜（EDS）等表征分析手段分別研究所制備的 Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱的結構和形貌特征.圖2（a）為 Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱和降解殼聚糖的紅外光譜圖.降解殼聚糖在 2972～3496cm^-1 出現較寬的強吸收峰，主要為 O-H 與 N-H 的伸縮振動吸收峰，同時分別在 1578cm^-1 和 1374cm^-1 存在 N-H 和 O-H 彎曲振動吸收峰；這3處強吸收峰在 Cu²⁺ 、Zn²⁺ 固載硅膠整體柱材料的紅外光譜圖中明顯減弱，說明在整體柱制備過程中，引入的 Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 與殼聚糖分子中的一OH 和一 NH₂ 形成了配位鍵；其次在 Cu²⁺ ！ Zn²⁺ 固載硅膠整體柱的紅外譜圖中，可以看出948cm^-1 和 1 034cm^-1 分別為 Si-O-H 和 Si-O-Si 振動吸收峰，表明硅膠被成功引入至整體柱材料.圖2（b）為整體柱的SEM電鏡照片， Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱主要由顆粒堆集而成.圖2（c）對材料的EDS分析結果表明該材料主要由C、N、O、Si和 Cu 或 Zn 組成.上述結果表明，本實驗已分別成功制備 Cu²⁺ ！ Zn²⁺ 固載硅膠整體柱.

2.2 整體柱固相微萃取（SPME）條件優化

本研究分別選取丙酮、乙酸乙酯、乙腈、乙腈/水 （9/1，V/V） 、甲醇作為溶劑稀釋得到相同濃度的系列8-OHdG標準溶液，探究不同種類萃取溶劑對整體柱富集8-OHdG的影響，如圖3（a）所示.結果表明，隨著溶劑極性增大，溶劑與8-OHdG分子間作用力增加，從而使8-OHdG在溶劑中的分配比例增加，降低了萃取整體柱對 8-OHdG 的富集效率.當選擇乙腈作為萃取溶劑時，整體柱對 8-OHdG 的富集倍數最大，萃取效率也最高，因此本實驗選取乙腈作為萃取溶劑.對萃取速率的優化結果見圖3（b），當萃取速率大于 50μL?min^-1 時，所制備 Cu²⁺，Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對8-OHdG 的萃取效果呈現明顯下降趨勢，因此選擇 50μL?min^-1 （20為最佳萃取速率.選擇合適的解吸溶劑對有效提高材料的萃取效果具有重要影響，對解吸溶劑優化結果見圖3（c）.當解吸溶劑選擇甲醇/氨水 （9/1，V/V） ）時，8-OHdG的回收率最高，整體柱對其富集倍數最大，分析原因可能是8-OHdG分子中含有 -NH--，-OH 等極性基團，適當地增加氨水的量，有利于增大解吸劑的極性，從而使得 8-OHdG 更易被洗脫，同時，8-OHdG 分子咪唑環上一OH 表現為弱酸性.在一定的堿性條件下，有利于將吸附在萃取材料上的8-OHdG 洗脫.因此，本實驗選取甲醇/氨水 （9/1，V/V） 作為解吸溶劑.萃取過程的解吸速率和解吸體積優化結果如圖3（d，e），當選擇 30μL?min^-1 的解吸速率和 37.50μL 洗脫溶液，可以得到最佳的萃取效果，

綜上，當選擇 2.5mL 乙腈稀釋的 0.018μmol?L^-1 8-OHdG 溶液，在 50μL?min^-1 流速下進行萃取時，以甲醇/氨水 （9/1，V/V） 的混合溶液為洗脫劑，在 30μL?min^-1 的速率下，取 37.50μL 洗脫溶液，所制備的 Cu²⁺，Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對8-OHdG 的富集倍數分別達到61.64 和51.20.

2.3 整體柱萃取性能研究

選擇芘、雙酚A、萊克多巴胺和8-OHdG為分析對象，通過研究 Cu²⁺ ！ Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對其萃取性能的區別，考察所制備整體柱對8-OHdG 的萃取效果，結果如圖4所示.芘、雙酚A、萊克多巴胺和8-OHdG分子結構中所含 -OH，-NH₂ 逐漸增多，萃取實驗顯示，其在 Cu²⁺，Zn²⁺ 固載硅膠整體柱上的富集倍數也有逐步增大的趨勢.說明整體柱對分析對象的富集倍數隨著 Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 與分析對象中- Γ-OH，-NH₂ 之間作用力的增大而升高.結果表明， Cu²⁺，Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對8-OHdG有一定的萃取選擇優勢，

新制備 Cu²⁺，Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對8-OHdG 的最大富集量分別為 756μg?g^-1 和 689μg?g^-1 .不同批次的 Cu²⁺，Zn²⁺ 固載硅膠整體柱的重現性，標準偏差 （RSD 分別為 5.12%.5.56% ，可見整體柱制備的重現性良好；同一批次所得整體柱的萃取重現性，日間 RSD 分別為 3.85%.3.69% ，日內 RSD 分別為 1.13% 、1.61% ，表明整體柱的萃取穩定性較好.

2.4 分析方法評價

以8-OHdG標準溶液為分析對象，結合制備的 Cu²⁺ ！ Zn²⁺ 固載硅膠整體柱，構建SPME-HPLC-UV分析檢測方法，見表1.8-OHdG在較寬的濃度范圍 （0.91～100nmol?L^-1 和 1.22～100nmol?L^-1 內線性良好 （R²gt;0.99） ）.方法的最低檢出限分別達到0.31和 0.42nmol?L^-1 .依據文獻報道[23]，健康人群尿樣中8-OHdG濃度為 12.0～23.0nmol?L^-1 ，本研究所建立的方法適用于檢測實際尿樣中8-OHdG.

如表2所示，本實驗所制備Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對8-OHdG的富集倍數分別是61.64和51.20，而氧化石墨烯/有機聚合物整體柱離線的富集倍數是 5^[24] ，可見， Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱對8-OHdG具有顯著的萃取富集性能.基于Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱構建的SPME方法，結合普通HPLC-UV裝置，所建立的8-OHdG分析檢測方法的檢出限 （S/N=3） 分別為 0.31nmol? （204號L^-1 和 0.42nmol?L^-1 ，其靈敏度接近于高靈敏的HPLC-MS和HPLC-ECD分析方法，可見所制備的 Cu²⁺ 、 Zn²⁺ 固載硅膠整體柱具有較高的萃取富集性能，建立的SPME-HPLC-UV有效提高了普通UV檢測器的分析靈敏度.

2.5 實際樣品分析

將建立的 Cu²⁺ 固載硅膠整體柱 SPME-HPLC-UV方法檢測實際尿樣中8-OHdG，來驗證方法的實用性.通過在已知8-OHdG含量的尿液中分別加入5.0、25.0和 50.0nmol?L^-1 濃度的8-OHdG標準溶液，按照1.2.3操作步驟進行，并通過 SPME-HPLC-UV檢測，所得加標回收率和精密度見表3，加標回收率在91.5%～102.0% 之間，日內相對標準偏差（RSD）在 2.7%～4.7% 之間，日間相對標準偏差（RSD）在 5.9%～ 9.7% 之間.結果表明，本研究所建立的SPME-HPLC-UV方法檢出限較低，靈敏且可靠，能夠準確檢測出實際尿樣中的8-OHdG，滿足定量分析的要求.

隨機收集本地15名健康志愿者 （20～40 歲）晨尿，實際尿樣檢測色譜圖見圖5.利用所建立的分析方法測定尿樣中8-OHdG的含量，結果顯示，20歲左右年輕人和不吸煙人群尿樣中8-OHdG含量在 11～16nmol?L^-1 ，吸煙人群尿樣中8-OHdG含量有所增加，在 23～30nmol?L^-1 之間.香煙中含有大量自由基和致癌物，吸入人體后可直接導致DNA氧化損傷，因而8-OHdG含量明顯升高.

3結論

通過溶膠-凝膠法，利用自組裝技術制備Cu²⁺，Zn²⁺ 離子固載硅膠整體柱，經過FT-IR、SEM和EDS分析對整體柱材料的結構和形貌進行表征.通過殼聚糖分子結構中的一OH和一 NH₂"提供的配位作用， Cu²⁺，Zn²⁺"被成功修飾至硅膠整體柱.以8-OHdG標準溶液為萃取對象，優化了 Cu²⁺，Zn²⁺"離子固載硅膠整體柱 SPME 條件，結合HPLC-UV建立了8-OHdG 定量分析方法.該方法在 0.91～100 和 1.22～ 100nmol?L^-1"擬合的相關系數均 gt;0.99，LODs 分別為0.31和 0.42nmol?L^-1"，表明本研究所制備的Cu²⁺，Zn²⁺"固載硅膠整體柱對8-OHdG 有良好的富集性能，所建立的 SPME-HPLC-UV分析方法具有靈敏度高、操作簡單、實用性強等特點，為實際樣品中8-OHdG的檢測提供了實用的分析方法.

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Peng Chuanyun，Yuan Mukun，Li Shuqi，Liu Hongyan，Zhang Shaowen，Wu Chunlai，Zhao Dan，Miao Yalei

（Schoolof Environmental Engineering and Chemistry，Luoyang Instituteof Science and Technology，Luoyang 47023，China）

Abstract： 8-hydroxy-2-deoxyguanosine（8-OHdG），as an typical biomarker，is commonly used to evaluate DNA damage. Cu²⁺ and Zn²⁺ were successfully grafted to silica using sol-gel method through self-assembly technique. The extraction properties of the prepared monoliths were investigated when applied in solid-phase micro-extraction（SPME）of trace8-OHdG in complexsamples.Under theoptimizedextractionconditions，theanalytical methdof8-OHdGinurine wasestablished coupling with high performance liquid chromatography-ultraviolet（HPLC-UV）.As theresults showed，the extraction factorsof the Cu²⁺ and Zn²⁺ grafted silica monoliths for8-OHdG were 61.64 and 51.2O，respectively，which indicated an excellnt extraction property.The linearrangesof established SPME-HPLC-UVanalytical methods were within therangofO.91-100 and 1.22-100nmol?L^-1 with R²gt;0.99 ，respectively. Satisfactory sensitivity were obtained with the LODs（S/N=3） ）of 0.31and 0.42nmol?L^-1 . The spiking recoveries of 3 spiking level adding to real samples were from 91.5% to 102.0% based on the Cu²⁺ grafed silica proposed analysis method. The intra-day and inter-day RSDs were in the range of 2.7% and 9.7%（n=3） Succesful applicationsillustratedthatthedeveloped SPME-HPLC-UVanalysis were sensitive，reliable，andacuratefordetection of 8-OHdG in urinary sample.

Keywords： Cu²⁺ grafted silica monolith; Zn²⁺ grafted silica monolith； sol-gel; solid phase micro-extraction;8-OHdG