梵凈山石斛林下仿野生撫育試驗及其多糖和甘露糖含量測定

中圖分類號S567. 23⁺9 （20 文獻標識碼A 文章編號 0517-6611（2025）11-0167-05

d oi;10.3969/j . issn. 0517-6611.2025.11. 036

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Experimental StudyonImitation WildTendingof Dendrobium fanjingshanenseintheForestandDeterminationofContentsof Its Polysaccharide and Mannose

CHENG Yun¹ ，WANG Hai1，TANShan-cai2 etal（1.Tongren Agricultural andRural Bureau，Tongren，Guizhou 5543O0;2.Tongren Poly technic College，Tongren，Guizhou 554300）

AbstractObjetie]TostudythegrowthcharacteriticsofDendrobmfanjngshanensefromimitationwildtendingintheforestanddeter minethecontentofplsaccharideandmaose.MethodUsinghangingots，achedtresandatachedstonsuderteforsttosilate thewildabitatgothofndrobfjgshestntentofolahadsiDendrobmfjgsheseasdtdbol sulfuricacidmetho，ndthemaoseontentwasdeterinedbyprecolunderivatizationultra-highpeforanceliquidhoatgaphy （UPLC）.ResultTheeight，freshweightanddryweightofDendrobmfajingshnensegrowninhangingpotsundertheforestweresignificantly higher than those grown in attached stones and trees （ Plt;0.05 ）. The polysaccharide and mannose contents of Dendrobium fanjingshanense grown in hanging pots were 20.41% and 14.23% ，respectively. Compared with Dendrobium fanjingshanense grown in attached stones andtrs，thepolysaccarideandmaosecontentsofDendrobiumfanjingshanensegrownihangingpotsweresignificantlydiernt（ Plt; 0.05）.[Conclusion]Hangingpotsundertheforestforurturingisanfeiewaytoiitatonwildtendingandcultivatehigualityand high-yielding of Dendrobium fanjingshanense.

Key wordsImitation wild tending;Dendrobium fanjingshanense;Growth characteristics;Polysaccharide;Mannose

梵凈山石斛（Dendrobium fanjingshanense Z.H. Tsi ex X.H.JinetY.W.Zhang）屬于蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Den-drobium）多年附生草本植物，葉生于莖的上部，先端稍鈍、稍有鉤轉，花苞片在基部或近中部具有一赤褐色斑塊，花黃色，花被片反卷，為石斛屬特征明顯的物種[1，是2001年在貴州省梵凈山海拔 800～1450m 的高大樹枝上以及山谷和林緣的巖石上發現的新種[2]，2010年在浙江省遂昌九龍山發現有少量分布，附生于海拔 500～700m 闊葉林中的毛紅椿樹上或山體巖石上[3]。梵凈山石斛種子在自然狀態下繁殖率極低，分布區域狹窄[4]，以及人為過度采挖，僅在梵凈山黑灣河懸崖及高大樹枝上偶有發現，正面臨著瀕危狀態，國家林業和草業局以及農業農村部將梵凈山石斛列入《國家重點保護野生植物名錄》二級[5]。《貴州中草藥資源研究》記載：梵凈山石斛具有清熱養陰、潤肺生津、益腎養胃和明自強腰的功效，主治口干煩渴、熱病傷津、肺熱干咳、腰膝軟弱、陰傷目暗等，是貴州珍稀特有的藥用植物[6。可見，積極探索梵凈山石斛仿野生撫育對保護種質資源和開發應用藥用價值具有重要的意義。

目前針對梵凈山石斛的研究主要聚焦于以種子和帶節莖段為外植體建立快速繁殖體系[7-8]，以及梵凈山石斛營養成分、礦質元素、多糖、石斛堿等含量的測定[9-10]，林下仿野生撫育是珍稀瀕危梵凈山石斛保護的關鍵環節，但報道較少，且活性成分甘露糖的檢測也鮮見研究。仿野生撫育是物種保護、野生資源再生利用和產業化發展的最有效措施，也是名貴中藥材產業發展的方向[\"]。石斛適宜在涼爽、濕潤和空氣暢通的半陰半陽的環境中生長[12]，筆者利用林下吊盆、附樹和附石仿野生撫育梵凈山石斛，開展不同撫育方式的梵凈山石斛生長特性及其活性成分多糖和甘露糖含量的評價，為建立梵凈山石斛物種保護基地和利用空間高效發展林下經濟提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。梵凈山石斛，購自，1.5年生組織培養馴化苗，由胡美忠教授鑒定為蘭科植物石斛屬梵凈山石斛。1.1.2試劑。D-甘露糖對照品，北京北方偉業計量技術研究院，批號BWJ4319，純度 ?99.9% ；鹽酸氨基葡萄糖，上海源葉生物科技有限公司，批號B214382，純度 ?98% ;D-葡萄糖對照品，北京北方偉業計量技術研究院，批號BWJ4289-2016，純度 ?99.7% ;乙晴，色譜純，美國FisherScientific公司：1-苯基-3甲基 ÷5- 吡唑啉酮（PMP），上海凜恩科技發展有限公司；氫氧化鈉、苯酚、三氯甲烷、硫酸、甲醇、乙酸銨、鹽酸、乙醇為化學純。

1.1.3儀器。ACQUITYUPLCTMI-Class系統，美國Waters公司;ACQUITY UPLC BEH C₁₈（100mm×2.1mm，1.7μm） 色譜柱，美國Waters公司；T-10紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；TDZ5-WS低速離心機，東旺化玻儀器有限公司；DELTA 320pH 計，梅特勒-托利多儀器有限公司；BXH-210G電熱鼓風干燥箱，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；NewHumanPowerI超純水儀，上海圣科儀器設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1梵凈山石斛林下仿野生撫育。試驗地點為貴州省的松樹林下同一區域，海拔 840m 遮陰度在 70%～75% ，林下安裝自動噴灌設施，確保林下濕度70% 左右[13]；安裝智能變頻多功能超聲波驅蟲器，確保無蟲害。試驗分林下吊盆撫育、附石撫育和附樹撫育3組，每組15叢，每叢3株。

1.2.1.1林下吊盆撫育。選擇直徑約 8cm 粗細、耐腐爛、強承受力的塑料管，沿水平方向的松樹以無紡布棉繩索和竹釘將其固定在松樹主莖上，距地面約 80cm ，將裝有松鱗和碎石（比例 8：2 ）[14]均勻混合基質、底部具網狀小孔塑料花盆掛于塑料管上，塑料花盆盆底距地面 50cm 左右，梵凈山石斛植于基質中，基質表面覆蓋青苔，每盆1叢，盆間距 25cm 。

1.2.1.2林下附石撫育。將梵凈山石斛塞入巖石縫中，用碎石和青苔將其基部塞緊，或將梵凈山石斛植入已打好的石槽內，基部和根用碎石和青苔均勻地壓實，應力求穩固，以風吹不倒為宜，確保種苗牢固地貼在石頭上，每窩1叢，窩間距25cm 。

1.2.1.3林下附樹撫育。選擇樹干粗大、樹冠較茂盛、樹皮較厚疏松、有縱裂溝的松樹，采用無紡布棉繩索和竹釘進行雙重固定，確保梵凈山石斛須根、植株以及青苔于樹干上，防正風力和雨水沖刷，從而促進新根的生長并使其緊貼樹干，距地面 120cm ，沿松樹主桿水平方向1周3叢，沿松樹主桿方向叢間距 40cm 。

1.2.2林下不同撫育方式的梵凈山石斛高度和質量測定。選擇1.5年生梵凈山石斛馴化苗（保留須根5根和葉片5片）開展林下吊盆、林下附石和林下附樹仿野生撫育，每株暴露在空氣中高度 10cm 左右。自2022年3月17日開始撫育，撫育時間1.5年，于2023年9月17日剪下暴露在空氣中梵凈山石斛植株，測定每株梵凈山石斛高度，計算每組梵凈山石斛平均株高；測定每組梵凈山石斛總重，計算每組每株梵凈山石斛平均鮮重；將梵凈山石斛在 50^qC 下鼓風干燥烘干，計算每組每株梵凈山石斛平均干重。

1.2.3梵凈山石斛多糖樣品制備。

1.2.3.1梵凈山石斛樣品處理。將1.5年生的梵凈山石斛 剪去葉、花梗和須根，洗凈，得梵凈山石斛鮮莖。鮮莖在鼓風 干燥箱中 50^qC 下干燥，待梵凈山石斛莖較干變得柔軟，將其 在超凈工作臺上人工揉搓去掉莖上的鞘膜，凈制后的梵凈山 石斛莖切段 5～6mm ，再干燥至含水分 5% 以內，用藥碾粉粹， 過40目藥篩，得梵凈山石斛藥材粉末樣品。

1.2.3.2梵凈山石斛多糖提取。分別精確稱取等質量 （0.5g） 的吊盆、附石和附樹仿野生撫育的梵凈山石斛藥材 粉末樣品，分別置于 250mL 三角瓶中，按料液比 1：300 （g： mL）添加超純水，采用熱回流提取法在 70% 下提取 2h ，提取 液過濾后，加超純水定容至 250mL 容量瓶，得梵凈山石斛多 糖提取液。每種梵凈山石斛藥材粉末樣品做3個平行樣。

1.2.3.3梵凈山石斛多糖純化。將 2mL 梵凈山石斛多糖 提取液和 10mL 無水乙醇加入離心管中，混合搖勻，冷藏靜 置 60min，4000r/min 離心 20min 后，用移液管吸去上清液， 用 2mL 無水乙醇反復清洗沉淀3次，在 50^qC 下鼓風干燥至 恒重，得梵凈山石斛多糖樣品。

1.2.4不同仿野生撫育方式的梵凈山石斛多糖含量測定。

1.2.4.1葡萄糖對照品標準曲線的建立。精確稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品 9.5mg ，置于 100mL 容量瓶中，加超純水至刻度線，得到 95μg/mL 對照品溶液，搖勻、冷藏，備用。分別精密量取葡萄糖對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于 10mL 具塞試管，加超純水補足 1mL ，參考苯酚-硫酸法利用紫外分光光度計在 488nm 處測定不同濃度對照品溶液的吸光度A，建立葡糖糖對照品溶液吸光度 （y） -濃度 （x） 對應的標準曲線方程[15]

1.2.4.2梵凈山石斛多糖含量的測定。精密量取梵凈山石斛多糖樣品溶液 1mL 于 10mL 具塞試管，參考用苯酚-硫酸法利用紫外分光光度計在 488nm 處測定林下不同撫育方式的梵凈山石斛多糖樣品溶液的吸光度，利用標準曲線方程計算梵凈山石斛多糖含量。

1.2.5梵凈山石斛中單糖分析。

1.2.5.1內標液和對照品溶液的配制。準確稱取鹽酸氨基葡萄糖 0.3g ，置于 25mL 容量瓶中，加超純水混合溶解，定容至刻度，搖勻、靜置，得到 12mg/mL 的鹽酸氨基葡萄糖溶液，作為內標溶液;精確稱取甘露糖 0.5g ，置于 100mL 容量瓶中，加超純水混合溶解，定容至刻度，搖勻、靜置，得到5mg/mL 的 D- 甘露糖對照品溶液；精確稱量D-葡萄糖32.5mg ，置于 25mL 容量瓶中，加超純水混合溶解，定容至刻度，搖勻、靜置，得到 1.3mg/mL 的葡萄糖對照品溶液。

1.2.5.2超高效液相色譜（UPLC）條件。色譜柱為ACQU-ITYUPLC BEH C₁₈ （ 100mm×2. 1mm，1. 7μm） ，以乙腈-0.02mol/L 乙酸銨溶液（ 20：80 ）為流動相，檢測波長250nm ，流速 0.3mL/min ，進樣量 1μL ，柱溫和進樣器的溫度維持 35^°C 。

1.2.5.3校正因子 （f） 測定。準確量取 5mg/mL 甘露糖對照品溶液 10mL 于 100mL 容量瓶中，精密加入內標溶液1mL ，加超純水至刻度，充分混合，得 0. 12mg/mL 鹽酸氨基葡萄糖和 0.5mg/mL 甘露糖內標-對照品混合溶液。依次吸取內標-對照品混合溶液 400μL，0.5mol/L 衍生劑PMP甲醇溶液 400μL 和 0.3mol/L 氫氧化鈉溶液 400μL 于 5mL 離心管中，混合搖勻，在 70% 水浴中衍生化反應 100min 后，于室溫條件下，加 0.3mol/L 鹽酸溶液 500μL 中和，加入三氯甲烷 2mL 洗滌除去游離的衍生劑PMP，棄去三氯甲烷，重復3＼～4次后，水層離心、過濾。濾液按“1.2.5.2”色譜條件進樣、檢測。根據鹽酸氨基葡萄糖內標溶液和甘露糖對照品溶液的色譜峰面積和濃度，按以下公式計算校正因子 （f） ：

式中： ?：A_s=1_s 為內標物峰面積； A_r 為甘露糖峰面積; C_s 為內標物濃度（ mg/mL \" C_r 為甘露糖濃度（ ）°

1.2.5.4甘露糖對照品標準曲線繪制。精密移取 5mg/mL 甘露糖對照品溶液 2，4，10，20 和 40mL ，分別置于 100mL 容量瓶中，分別精密加入內標溶液 1mL ，加超純水至刻度，搖勻，得 0.12mg/mL 鹽酸氨基葡萄糖和 0.1、0.2、0.5、1.0 2.0mg/mL 甘露糖內標-對照品混合溶液。自“1.2.5.3”中“依次吸取內標-對照品混合溶液 400μL ”起，依次操作，根據鹽酸氨基葡萄糖內標溶液和甘露糖對照品溶液的色譜峰面積和濃度，計算校正因子 （f） ，以甘露糖對照品校正濃度（C） 為橫坐標、色譜峰面積 （A） 為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5.5梵凈山石斛多糖樣品溶液的水解。將梵凈山石斛多糖樣品加 2mL 熱水溶解，置安瓿瓶中，加 3.0mol/L 鹽酸溶液 0.5mL ，封口，均勻混合，將安瓿瓶密閉封口后，置于110^°C 水溶環境中水解1h，待冷卻后，用 3.0mol/L 氫氧化鈉溶液調節 pH 至中性，加入 2mL 鹽酸氨基葡萄糖內標液，轉移至 10mL 容量瓶，加超純水定容至刻度，得含內標液的梵凈山石斛多糖樣品水解液。

1.2.5.6 梵凈山石斛單糖組成。將鹽酸氨基葡萄糖和甘露糖內標-對照品混合溶液、鹽酸氨基葡萄糖和葡萄糖內標-對照品混合溶液、梵凈山石斛多糖樣品水解液，自“1.2.5.3”中“依次吸取內標-對照品混合溶液 400μL^′ 起，分別依次操作，按\"1.2.5.2”色譜條件進樣、檢測。對比鹽酸氨基葡萄糖校準品、甘露糖對照品、葡萄糖對照品色譜峰保留時間，分析梵凈山石斛單糖組成；根據甘露糖和葡萄糖色譜峰面積，計算甘露糖和葡萄糖色譜峰面積比值（ S_####：S_####： ;利用甘露糖色譜峰面積，按照甘露糖對照品標準曲線方程，計算不同撫育方式下的梵凈山石斛中甘露糖含量，以探究林下仿野生撫育的適宜方式。

1.3數據處理利用SPSS23.0 軟件對林下不同仿野生撫育方式的梵凈山石斛株高、鮮重、干重、折干率以及多糖和甘露糖含量進行組間差異性分析， Plt;0.05 為顯著差異。

2 結果與分析

2.1林下不同仿野生撫育方式對梵凈山石斛生長特性的影 響從表1可以看出，林下吊盆、附樹和附石撫育的梵凈山 石斛生長特性在株高、鮮重、干重和折干率方面表現出一定 的差異性。林下不同仿野生撫育的梵凈山石斛株高和鮮重 從大到小依次為吊盆 gt; 附石 gt; 附樹，吊盆、附石、附樹撫育的 梵凈山石斛株高和鮮重之間均具有顯著差異（ Plt;0.05， ；與 附石和附樹撫育的梵凈山石斛比較，吊盆撫育的梵凈山石斛 干重具有顯著差異（ Plt;0.05 ），而附石和附樹撫育的梵凈山 石斛干重差異不顯著（ Pgt;0.05） ；與附石撫育的梵凈山石斛 比較，吊盆和附樹撫育的梵凈山石斛折干率具有顯著差異 0 Plt;0.05） ，而吊盆和附樹撫育的梵凈山石斛折干率差異不 顯著（ Pgt;0.05） 。

由此可見，從梵凈山石斛株高和鮮重來評價，林下吊盆仿野生撫育長勢優于附石和附樹撫育，附石仿野生撫育長勢優于附樹撫育;從凈產量（干重）來評價，林下吊盆仿野生撫育優于附石和附樹撫育，附石和附樹仿野生撫育沒有顯著差異。

2.2林下不同仿野生撫育方式對梵凈山石斛多糖含量的影

響根據葡萄糖對照品溶液吸光度 （y） -濃度 （x） 對應的標準曲線方程 y=0. 055 8x+0. 13 97（ R²=0.9995 ）[15]計算林下不同撫育梵凈山石斛多糖含量。從表1可以看出，林下吊盆、附石和附樹仿野生撫育多糖含量分別為 20.41%.18.58% 和 18.27% ，與附石、附樹撫育的梵凈山石斛比較，吊盆撫育的梵凈山石斛多糖含量具有顯著差異（ Plt;0.05 ，而附樹和附石撫育的梵凈山石斛多糖含量沒有顯著差異（ ）

從多糖含量來評價，林下吊盆仿野生撫育優于附石和附樹撫育。

綜上考慮，從梵凈山石斛多糖含量和干重綜合評價，林下吊盆撫育優于附石和附樹撫育。林下吊盆撫育以松樹皮和碎石為主要基質，表面覆有青苔，有利于保濕和保存養料；附石撫育和附樹撫育的梵凈山石斛根裸露在空氣中，得不到充足的養分和水分，生長緩慢。仿野生撫育方式的不同使多糖含量和干重表現明顯差異，可能與撫育基質的保濕、保存養料有關。

2.3林下不同仿野生撫育方式對梵凈山石斛甘露糖含量的影響該試驗利用超高效液相色譜法（UPLC）分離、鑒定和定量分析多糖水解液樣品中甘露糖，提高了分離鑒定效率；以鹽酸氨基葡萄糖為內標物，采用內標法建立標準曲線測定甘露糖的含量，消除由于進樣量、儀器波動等因素引起的誤差，從而提高定量的準確性。

如圖1所示，梵凈山石斛多糖由單糖甘露糖和葡萄糖組成，林下吊盆、附石和附樹仿野生撫育的梵凈山石斛甘露糖和葡萄糖色譜峰面積比值分別為11.13、10.97和11.20，林下不同仿野生撫育方式對甘露糖和葡萄糖色譜峰面積比值影響差異不顯著（ Pgt;0.05） 。2020年版《中國藥典》規定鐵皮石斛甘露糖和葡萄糖色譜峰面積比值必須符合 2.4～8.0 的要求[16]，梵凈山石斛甘露糖和葡萄糖色譜峰面積比值超出了該規定，說明梵凈山石斛單糖主要為甘露糖。

在\"1.2.5.2”色譜條件下，樣品中甘露糖和葡萄糖色譜峰出峰時間分別為4.28和 7.76min ，比羅秋蓮等[17]報道的鐵皮石斛甘露糖和葡萄糖出峰時間分別少4.61 和 8.35min 比譚善財等[15]報道的鐵皮石斛甘露糖和葡萄糖出峰時間分別少6.52和 5.05min 。可見，在該試驗的色譜條件下，石斛中甘露糖和葡萄糖能實現較好分離，節約時間，提高分離效率。

“1.2.5.3”中的公式計算出校正因子 f 為6.51。根據鹽酸氨基葡萄糖內標溶液和甘露糖對照品溶液的色譜峰面積、濃度、校正因子 （f） ，計算甘露糖校正濃度，建立了甘露糖色譜峰面積 （y）- 甘露糖校正濃度 （x） 的標準曲線方程 y=4x 10⁶x+19063 （ R²=0.9992 ），表明甘露糖校正濃度在 0.038～ 0.433mg/mL 與其對應的色譜峰面積具有較好的線性關系（圖2）。

根據梵凈山石斛多糖樣品水解液中甘露糖色譜峰面積，按照標準曲線方程計算林下吊盆、附樹和附石不同撫育方式的梵凈山石斛中甘露糖含量，分別為 14.23%.13.30% 13.11% ，與附石和附樹撫育的梵凈山石斛比較，吊盆撫育的梵凈山石斛甘露糖含量具有顯著差異（ Plt;0.05） ，而附石和附樹撫育的梵凈山石斛多糖含量沒有顯著差異（ Pgt;0.05） 0從甘露糖含量來評價，林下吊盆仿野生撫育優于附石和附樹撫育。2020年版《中國藥典》規定鐵皮石斛甘露糖含量應為13.0%～38.0% ，林下不同撫育方式的梵凈山石斛甘露糖含量均大于 13.0% ，說明林下撫育梵凈山是甘露糖提取的天然優質資源。

綜上，梵凈山石斛多糖和甘露糖在林下吊盆、附石和附 樹培育過程中呈現出相似的變化趨勢，表明培育基質、養分、 水分等外部環境因素對梵凈山石斛多糖和甘露糖含量的調 控作用較為顯著。

3結論與討論

在林下野生生境開展梵凈山石斛人工馴化苗吊盆、附樹和附石仿野生栽培，利用自動噴灌系統保濕、超聲波驅蟲器防蟲等人為干擾措施，模擬野生生境，探索林下仿野生撫育，為建立梵凈山石斛保護基地提供參考。從梵凈山石斛產量、多糖和甘露糖含量以及資源開發和產業發展等綜合評價，林下吊盆撫育優于附石和附樹撫育，是仿野生撫育及優質高產栽培的有效方式；從操作復雜程度和珍稀瀕危物種保護的角度評價，林下附石和附樹撫育也是有效措施。

2023年國家衛生健康委員會和國家市場監督管理總局將鐵皮石斛納入藥食同源物質目錄[18]。現代藥理學研究結果顯示，石斛多糖和甘露糖是鐵皮石斛的主要活性物質，在醫藥、保健、食品和化妝品等領域具有廣泛的應用前景[19-26] 。該試驗研究結果表明，林下仿野生撫育的梵凈山石斛中多糖含量在 18.27%～20.41% ，未能達到2020年版《中國藥典》規定的鐵皮石斛多糖含量標準（不低于 25.0% ），也是天然多糖提取的重要原料，具有一定的開發價值；甘露糖含量在13.11%～14.23% ，達到了2020年版《中國藥典》規定的鐵皮石斛中甘露糖含量標準（ 13.0%～38.0% ；甘露糖和葡萄糖的色譜峰面積比值在 10.97～11.20 ，高于2020年版《中國藥典》規定的鐵皮石斛中甘露糖與葡萄糖的色譜峰面積比值（2.4～8.0） ，說明梵凈山石斛中單糖主要為甘露糖，可以做天然甘露糖純化的重要原料。

發揮梵凈山地理優勢，模擬野生生境，開展林下仿野生撫育，建立仿野生梵凈山石斛基地，能提高梵凈山石斛品質和產量，實現物種保護、生態建設和產業發展相融合[27-29]，為其資源開發利用提供原材料。

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