迭代狂犬病疫苗：無血清狂犬病疫苗的研究進展

1 狂犬病

1.1狂犬病概述

狂犬病是一種由狂犬病病毒（Rabiesvirus）所誘發(fā)的疾病，對哺乳動物影響較大，特別是對狗、狼、狐貍等動物的影響非常大，且高度致命。而人類被傳染都是因為被感染的動物咬傷。狂犬病毒一旦發(fā)作，幾乎必然導致死亡，死亡率達到了 100% 。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的數(shù)據(jù)可知，在全球每年大概有59000人死于狂犬病，而其中大部分病例都出現(xiàn)在亞洲與非洲的發(fā)展中國家。因為缺乏有效的疫苗和預防措施，這些地區(qū)的狂犬病的負擔尤為沉重。

狂犬病疫苗是預防狂犬病感染的主要工具，無論是作為預防性接種還是作為治療性接種都具有重要意義。我國是目前世界上最大的人用狂犬病疫苗生產(chǎn)國和使用國，當今“萌寵經(jīng)濟”的不斷發(fā)展，和狂犬病發(fā)病后無藥可醫(yī)的現(xiàn)狀推動著狂犬病疫苗的不斷研發(fā)和更新迭代。

1.2傳統(tǒng)狂犬病疫苗的局限性

傳統(tǒng)狂犬病疫苗主要分為兩大類：一類是基于神經(jīng)組織制備的初代狂犬病減毒疫苗；另一類是第二代基于細胞培養(yǎng)技術的疫苗，如Vero細胞疫苗和人二倍體細胞疫苗。盡管這些疫苗的研發(fā)和推廣在一定程度上降低了狂犬病的發(fā)病率，但它們各自的局限性仍然存在。

神經(jīng)組織疫苗作為人類狂犬病預防領域“元老級”的免疫制劑之一，其誕生之初的制備工藝是從感染了狂犬病病毒的動物腦組織之中提取病毒抗原成分。這一類疫苗的生產(chǎn)成本非常低。但是，因其制備環(huán)節(jié)和神經(jīng)組織有著非常密切的聯(lián)系，在注射此類疫苗后很容易導致神經(jīng)炎、腦炎等嚴重不良反應，因而在很多國家和地區(qū)都已被淘汰。

第二代疫苗中的Vero細胞疫苗是目前全球應用最廣泛的狂犬病疫苗之一，其通過在非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）中培養(yǎng)狂犬病病毒來生產(chǎn)疫苗。盡管Vero細胞疫苗較為安全，但是其存在的問題也不容忽視。首先是在疫苗生產(chǎn)過程中殘留的Vero細胞DNA與蛋白質，這些雜質可能給接種者帶來過敏或其他不良反應。其次，這類疫苗的生產(chǎn)依賴大量的動物血清作為培養(yǎng)基成分，不僅增加生產(chǎn)成本，還可能會出現(xiàn)血清源性疾病的傳播問題。

人二倍體細胞疫苗被認為是目前最安全的狂犬病疫苗之一，雖然同樣以細胞為基質，但其區(qū)別于其他動物細胞，人源細胞基質使這種疫苗的純度高、雜質少、不良反應發(fā)生率較低。然而，人二倍體細胞疫苗的生產(chǎn)過程復雜，成本高昂，限制了其在發(fā)展中國家的廣泛應用。

1.3無血清狂犬病疫苗的發(fā)展背景

為解決傳統(tǒng)疫苗的不足，無血清狂犬病疫苗的設想應運而生。無血清疫苗在生產(chǎn)過程中不使用動物血清，從而大大降低疫苗的副作用和生產(chǎn)成本，提高了疫苗的安全性和有效性。無血清疫苗的研發(fā)主要聚焦于細胞培養(yǎng)技術的改進，同時純化技術和佐劑方面的研究也為無血清疫苗的研發(fā)帶來了幫助。近年來，隨著生物技術的發(fā)展，無血清狂犬病疫苗的研發(fā)取得了顯著進展，部分產(chǎn)品已進人臨床試驗階段，顯示出良好的應用前景。

無血清狂犬病疫苗的研發(fā)始于對細胞培養(yǎng)技術的改進。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)技術依賴動物血清提供必要的營養(yǎng)物質和生長因子，但這種方法存在諸多局限性。自從1996年Gibco推出第一款無血清培養(yǎng)基（Serum-FreeMedium，SFM）以來無血清培養(yǎng)基的研發(fā)從未停歇，這些培養(yǎng)基通過添加合成生長因子、激素和微量元素等成分，模擬體內環(huán)境，支持細胞的生長和病毒的生產(chǎn)[1]。無血清培養(yǎng)基的應用不僅提高了疫苗的安全性，解決了血清批間的一致性差異問題還降低了生產(chǎn)成本，簡化了生產(chǎn)工藝。

此外，科學家們還在病毒純化工藝方面取得了重要突破。傳統(tǒng)的病毒純化工藝依賴于超速離心和層析等技術，近年來，如膜過濾技術和親和層析技術等一系列的純化技術漸漸融入了研發(fā)和生產(chǎn)，這些技術不僅提高了病毒的純度和收率，提高疫苗成品的質量，還能簡化工藝流程，減少批間差異。

新型佐劑的開發(fā)也推動了無血清狂犬病疫苗的開發(fā)。佐劑是一種能夠增強疫苗免疫效果的輔助物質，常見的佐劑包括鋁鹽、脂質體和納米顆粒等。無血清狂犬疫苗的效價容易出現(xiàn)偏低的情況，通過新型佐劑的輔助不僅能夠提高疫苗的免疫效果，還能進一步降低疫苗的不良反應。近年來如CpG寡核苷酸和TLR激動劑等新型佐劑得到了開發(fā)，這些佐劑通過激活機體的免疫細胞，增強疫苗的免疫效果。

2無血清狂犬病疫苗的研究要點

2.1無血清細胞基質的研發(fā)

無血清狂犬病疫苗的研發(fā)始于20世紀末，科學家們嘗試使用不同的細胞系和培養(yǎng)基來替代傳統(tǒng)動物血清的添加。早期的研究主要集中在對細胞系的篩選和馴化、對培養(yǎng)基的選擇和成分的優(yōu)化，以得到能夠在無血清條件下正常生長和繁殖的細胞系。

在早期的研發(fā)過程中，科學家們還嘗試使用不同的細胞系來生產(chǎn)狂犬病疫苗。常用的細胞系包括Vero細胞、MDCK細胞和CHO細胞等。這些細胞系在無血清培養(yǎng)基中表現(xiàn)出良好的生長特性，且能夠高效地生產(chǎn)狂犬病病毒。通過對比不同細胞系的病毒產(chǎn)量和疫苗效力，Vero細胞具有較好的表現(xiàn)，以Vero細胞為細胞基質的狂犬病疫苗也是現(xiàn)在生產(chǎn)和使用的主流，目前在無血清狂犬疫苗方向上進行的研究也都以Vero細胞作為基質。

在實際的產(chǎn)品研發(fā)過程中，還需對目標細胞系進行無血清馴化，通過一步法或連續(xù)梯度法篩選馴化，以期得到能夠在無血清條件下正常生長增殖的細胞株。使用一步法馴化細胞時，細胞面對極大的培養(yǎng)基成分差距，通常產(chǎn)生很大壓力，少有細胞能夠成功接受，連續(xù)馴化使細胞梯度適應培養(yǎng)基成分的變化，在實際中應用更多（見表1）。

表1細胞連續(xù)馴化方法表

盡管設置了馴化梯度，當從第三階段轉變至第四階段時也非常困難，增加馴化梯度，減小培養(yǎng)基成分變化是常用的手段，細胞馴化這一工作耗時長，問題多，需要足夠的時間與經(jīng)驗，是無血清狂犬病疫苗研發(fā)的難點。

2.2馴化后細胞系的變化

經(jīng)過一系列的馴化過程，實現(xiàn)了細胞在無血清培養(yǎng)環(huán)境中正常生長和增殖的基本要求，但在此過程中細胞為適應新的生存環(huán)境也做出了改變，包括但不限于細胞形態(tài)改變、生長增殖速度變化、培養(yǎng)模式調整等，近些年的研究中還發(fā)現(xiàn)無血清培養(yǎng)對細胞免疫刺激能力的影響，經(jīng)馴化后細胞的代謝組學發(fā)生變化，可能影響其表型和功能這些現(xiàn)象是否指向細胞發(fā)生惡性轉化、發(fā)生變化的細胞是否還適合作為細胞基質進行病毒培養(yǎng)是實踐才能解決的問題[2]

2.3大規(guī)模無血清細胞培養(yǎng)的實現(xiàn)

在細胞培養(yǎng)技術方面，缺少血清保護的細胞貼壁能力減弱且更容易受到細胞損傷，傳統(tǒng)生物反應器培養(yǎng)過程中產(chǎn)生高剪切力，可能影響細胞活性[3]，WAVE生物反應器的推廣與使用給無血清疫苗的生產(chǎn)提供更優(yōu)良的條件。WAVE反應器通過波浪式的搖擺進行溫和且充分的混合，突破了傳統(tǒng)反應器的局限，有效地減小了剪切力對細胞的影響，同時作為一次性反應器系統(tǒng)，有效減少了污染風險，給無血清狂犬病疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供了堅實的基礎。

2.4純化工藝的優(yōu)化

純化工藝是疫苗生產(chǎn)的重要過程，盡可能地去除中間產(chǎn)品中的雜質且保持抗原結構和穩(wěn)定性一直是純化步驟的目標。無血清培養(yǎng)的整個生產(chǎn)過程中添加物成分簡單明確，降低了純化難度，進一步降低疫苗中宿主細胞DNA和蛋白質的殘留量4，避免高免疫原性和不必要的免疫反應，使無血清疫苗表現(xiàn)出高效和低敏性。但同時無血清疫苗常見的效價較低問題也給純化工藝帶來了挑戰(zhàn)。相信結合膜過濾技術和親和層析技術等新型純化技術的使用，未來將給無血清疫苗的質量帶來提升。

3無血清狂犬病疫苗的臨床試驗評估與進展

3.1無血清狂犬病疫苗的臨床評估要點

在臨床試驗中，監(jiān)測接種者的不良反應和免疫反應來評估無血清狂犬病疫苗的安全性和免疫原性是首要任務。不良反應包括局部反應（如注射部位疼痛、紅腫）和全身反應（如發(fā)熱、頭痛）。免疫反應主要通過測定接種者血液中的抗體水平來評估，特別是中和抗體的水平，這些抗體能夠有效中和狂犬病病毒，防止病毒感染。作為傳統(tǒng)有血清狂犬病疫苗的迭代產(chǎn)品，無血清狂犬病疫苗的效果是否具有同等的效果更是我們關注的重點。通過與Vero細胞有血清疫苗或人二倍體狂犬病疫苗免疫效果和安全性的對比，證明無血清狂犬病疫苗的非劣效性，將是其代替?zhèn)鹘y(tǒng)有血清疫苗占領狂犬病疫苗市場的關鍵。此外，狂犬病疫苗的接種情景包括狂犬病毒暴露的前后，暴露后預防（PEP）更常見于實際中，因此模擬PEP臨床試驗的結果也是關注重點。通常暴露后預防（PEP）的模擬通過在疫苗接種前為受試者在遠離疫苗注射的部位（如大腿前外側）肌內注射人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）來實現(xiàn)[5。在暴露前預防（PrEP）和PEP兩種免疫情況下都能達到免疫要求是對無血清狂犬病疫苗共同的期待。

3.2國外臨床試驗進展

早在上世紀末法國Sanofi公司就已經(jīng)展開了無血清狂犬病疫苗的研發(fā)工作，并且于2009年成功開展了針對PVRV-NG（新一代、無血清、無抗生素、純化的Vero細胞狂犬疫苗）無血清狂犬疫苗的首次臨床試驗[]。

PVRV-NG的開發(fā)基于Pitman-Moore病毒株，Sanofi公司此前使用同一毒株成功研制了人二倍體細胞疫苗（HDCV）和純化的Vero細胞狂犬病疫苗（PVRV）。PVRV-NG的生產(chǎn)不涉及任何動物源或人源成分。PVRV-NG純度高，殘留DNA含量低（ lt;100pg/ 劑），符合歐洲藥典、世界衛(wèi)生組織和美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的標準。但在針對其開展的第五次臨床試驗中（NCT01784874），未能證明其抗原相較于HDCV的非劣效性[8]。此后Sanofi公司對PVRV-NG配方進行了升級，增加了抗原含量，重新配制為PVRV-NG2，并在隨后的一項I期臨床研究（NCT03145766）和兩項Ⅱ期臨床研究（NCT03965962和NCT04478084）中驗證了PVRV-NG2的免疫原性和安全性在。

直至2024年底，Sanofi公司所組織開展的相關臨床試驗高達十項，其實驗地點包括我國、美國、法國、菲律賓和泰國等地，受試者涵蓋兒童和青少年以及成人。針對PVRV-NG2的臨床研究至今仍在進行。

3.3國內臨床試驗進展

相較于國外，國內對于無血清狂犬病疫苗的研究開展得較晚。盡管在Sanof公司開展早期動物實驗時就已經(jīng)注意到無血清狂犬病疫苗的廣闊前景[9-；但直至十年后才得到更廣泛的關注，并嘗試持續(xù)展開對無血清狂犬疫苗的研究。

國內狂犬疫苗市場競爭愈發(fā)激烈，尚無正式發(fā)售商品的無血清狂犬疫苗成了多家廠商近年的戰(zhàn)略目標。近年來，現(xiàn)代生物技術的發(fā)展進一步推動了無血清狂犬病疫苗的研發(fā)[]。目前，多款無血清狂犬病疫苗已進入臨床試驗階段，顯示出良好的安全性和免疫原性，不僅能夠快速激發(fā)機體的免疫反應，產(chǎn)生高滴度的中和抗體，且不良反應發(fā)生率低，這些進展為狂犬病的預防和控制提供了新的希望。

結語

無血清狂犬病疫苗以其提高的安全性和降低的生產(chǎn)成本顯示出了巨大的應用潛力。這類疫苗能夠有效避免由動物血清引起的過敏反應和血清源性疾病的風險，同時其更加可控的生產(chǎn)工藝將提高疫苗的質量。通過不斷的技術創(chuàng)新，無血清狂犬病疫苗有望成為未來狂犬病預防的主流選擇。

盡管無血清狂犬病疫苗的研發(fā)已取得顯著進展，但仍面臨非劣效性、生產(chǎn)復雜性及公眾接受度等挑戰(zhàn)。優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果仍然是今后研發(fā)的重點。此外，通過教育和宣傳，提高公眾對新型疫苗的認識和接受度也是推動無血清疫苗廣泛應用的關鍵。

展望未來，無血清狂犬病疫苗的研究將繼續(xù)聚焦于提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果。無血清狂犬病疫苗的研發(fā)不僅是對傳統(tǒng)疫苗技術的重大突破，也是全球公共衛(wèi)生領域的一項重要進展。通過不斷的技術創(chuàng)新和國際合作，無血清狂犬病疫苗有望在全球范圍內得到廣泛應用，為狂犬病的預防和控制提供有力的保障。未來，隨著生物技術的不斷進步，無血清狂犬病疫苗的研究將不斷深入，為人類健康事業(yè)作出更大的貢獻。

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收稿日期：2025-05-19

作者簡介：黃馨瑩（1997—），女，滿族，碩士研究生。研究方向：生物檢測工程。