森林草莓AHL基因家族鑒定分析及FveTEK的功能驗證

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5774（2025）02-0128-13

Identification of the AHL gene family and functional validation of FveTEKin Fragariavesca

Huang Kai1，Liu Heqing1，Wu Runqin，LinLixuan，Wang Fei，Chizuko Yamamuro1* （1.College of Horticulture，Fujian Agricultureand Forestry University，Fuzhou，Fujian 35ooo2， China; 2.ColegeofFuture Technology，Fujian AgricultureandForestry University，Fuzhou，Fujian 35ooo2，China; 3.College ofJunCaoScienceandEcology，Fujian AgricultureandForestry University，Fuzhou，Fujian 35oo02，China）

Abstract：【Objective】Thisstudy focusedon AHL genefamilyofFragaria vesca and aimed toanalyze its physicochemical properties， gene promoter Δcis -element and gene expression pattern analysis，and to validate the biological functionofFveTEK（FveAHLI6）.【Method】Aphylogenetictre was constructedfor theAHLgenefamilyofbothFragaria vescaandArabidopsis taliana.Thephysicochemical properties，conservedstructuralanalysis，ndpromotercis-elements of the AHL geneinFragariavesca were examined.Additionaly，an FveTEK-SRDX transcriptionrepressr expression vector wasconstructed，andthefunctionalityofthe FveTEK genewas validated through stable genetic transformation in Fragaria vesca.【Result】In Fragaria vesca，there are a total of12 AHLfamily members，categorized into two clades， Clade-Aand Clade-B，unevenly distributedacross seven chromosomes.Both conservative motif and gene structure analyses indicate thatFveAHLs exhibitahighdegreeofconservation throughout evolution.Analysis of promoter cis-acting elementssugested thatFveAHL genesare primarilyinvolved inlightresponse，growthand development，abioticstress responses，and plant hormoneregulation.The FveTEK gene spans8O1bpand encodes266aminoacid residues，featuring a conserved DUF296 domain spanning amino acids89-202 at the N-terminus.Subcelllarlocalization results indicated thattheFveTEK proteinislocalizedwithinthenucleus.Through genetictransformationinFragariavesca，FveTEK-SRDX transgenicplants wereobtained.FurtherqRT-PCRanalysisrevealedthattheexpressionofFveTEKintheFueTEK-SRDX lineswasdownregulated，ranging from O.O9 to0.6times thatof thewildtype（WT）.Phenotypeobservationandpollen viabilitytestingoftheFveTEK-SRDXlinesshoweddecreasedpollenviability，withmostself-pollnatedfruitsfailingto developandexpand normally.【Conclusion】This study identified theAHL gene familyinFragaria vesca，studied the ciselementsoftheFveAHLsgene promoteranditsexpressionindiferenttissues，andverifiedthattheinhibitionofFeTEK expresionleads tofruitabortion.Theseresultscanprovideimportanttheoreticalbasisforthedevelopmentofmalesterility breeding in Fragaria vesca.

Keywords： Fragaria vesca;AHL; gene familyanalysis;FveTEK; functional validation

栽培草莓（Fragariaananassa）是薔薇科草莓屬重要經濟作物，因其果實風味獨特、營養豐富而成為全球范圍內廣受歡迎的水果之一[1]。據最新統計，全球草莓種植面積已超過37萬 hm² ，廣泛應用于鮮食、加工和食品工業等領域[2-3]。森林草莓，廣泛分布于北半球的溫帶地區，其果實雖小但風味濃郁，具有重要的生態和經濟價值[4]。作為薔薇科草莓屬的典型代表，森林草莓因其生長周期短、基因組規模較小（約 240Mb ）以及易于實驗室培養等特性，在植物科學特別是果實發育機制、基因組學和分子育種研究中發揮了重要作用[5]。

AT-hook蛋白（AHL）作為一種古老的轉錄因子，廣泛存在于植物中，如擬南芥、水稻、大豆、玉米和高粱[6-8]。AHL參與植物生長發育多個轉錄調控過程。AHL家族主要包含AT-hook基序和PPC保守結構域[9]。其中，PPC結構域不僅介導蛋白的核定位及AHL家族成員間的互作，還能與其他轉錄調控因子結合，進而影響其轉錄調控活性[10]。最新研究證據顯示，PPC結構域在AHL蛋白的轉錄激活功能中起著關鍵調控作用[]。

多數AHL是開花時間的負調節因子。擬南芥AtAHL22在低溫下參與調控FLC樣基因，影響春化過程。AHL轉錄因子的核定位特征已被實驗證實[12]。AtAHL2O抑制FT表達，其蛋白可以與其他影響開花時間的旁系同源物形成異源三聚體。此外，AtAHL20直系同源物在亞麻薺中是 FT 的阻遏因子，這表明AHL在十字花科的功能保守［13]。蘋果中，MdAHL6通過與MdFT富含AT的啟動子序列結合，調節下胚軸和花相關基因的表達，其過表達導致下胚軸縮短和開花延遲[14]。花序形態發生和生殖器官的形成取決于協調的分生組織活動。在玉米中，AHL家族成員BAF1（BARRENSTALKFASTIGIATE1）調控玉米穗序的形成，并在腋生分生組織形成的早期發揮作用。BAF1作用于bHLH轉錄因子BA1（BARRENSTALKI）的上游，而BA1是腋生分生組織起始所必需的[15]。在擬南芥中，AHL21（GIANTKILLER；GIK）充當AG（AGAMOUS）的下游，調節ETT/ARF3（ETTIN/AUXINRESPONSEFACTOR3）和其他生殖器官形成相關基因的表達[16]。同時，研究發現AtAHL18也作用于AG的下游，調控雄蕊生長[17]。

在水稻中，PTC2（PERSISTENTTAPETALCELLS2）基因屬于AHL基因家族，其在擬南芥中最接近的推定直系同源物是AtAHL19和AtAHL20。ptc2突變體的花粉壁上角質層沉積被改變，可能是由于參與孢粉素生物合成的酶的表達被抑制了[18]。擬南芥中，過表達AtAHL2O抑制開花基因FT的表達，導致開花延遲，同時也與其他開花時間調控成員（AtAHL19，AtAHL22和AtAHL29）互作[14.19]AtAHL22通過修飾染色質結構延遲葉片衰老[19]。

研究表明，擬南芥AHL18轉錄因子通過調控根尖分生組織中細胞分裂的增殖活性，進而協調主根伸長與側根形成的發育進程[20]。在水稻中，OsAHL1基因編碼蛋白能夠特異性識別并結合特定順式作用元件，通過調節包括DREB1A在內的多個干旱響應基因的轉錄水平來增強植株的耐旱能力[21]。AHL通過影響染色質結構、DNA甲基化或組蛋白修飾等，實現對靶基因的轉錄調控，從而參與生長發育、脅迫響應等生物學功能。這些發現為進一步揭示AHL基因家族在細胞信號傳導和基因表達網絡中的作用提供了重要理論基礎

TEK基因屬于AT-HOOKMOTIFNUCLEARLOCALIZED（AHL）家族成員，在擬南芥絨氈層發育的四分體階段呈現特異性表達[22]。TEK基因的缺失會導致減數分裂后小孢子結構崩潰并降解，最終誘導雄性不育表型的發生。透射電鏡分析進一步揭示，tek突變體在小孢子發育后期雖然能形成花粉外壁外層的典型結構，但其外壁內層及花粉內壁的形成卻出現嚴重缺陷[23]。森林草莓中TEK功能缺失是否會導致雄性不育表型發生，仍待研究。本研究通過鑒定森林草莓FveAHL基因家族并驗證其家族成員FveTEK（FveAHL16）的生物學功能，進而為森林草莓雄性不育育種開發提供重要理論依據。

1材料與方法

1.1森林草莓FveAHL基因家族的鑒定

從薔薇科數據庫GDR（https：//www.rosaceae.org）下載森林草莓基因組、CDS、蛋白質和注釋文件。通過Tair數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥基因組文件。以擬南芥和番茄AHL家族成員蛋白序列為參考，使用TBtools軟件[24]對森林草莓全基因組AHL蛋白序列進行同源檢索，篩除重復序列后采用NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的在線工具CDD分析蛋白序列的保守結構域，剔除不含保守結構域的成員，并將篩選后的序列上傳到PFAM、SMART數據庫進一步分析其結構域，最終獲得森林草莓AHL基因家族成員。

1.2森林草莓FveAHL系統發育樹構建

利用ClustalW2.0軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2）進行多重序列對比，比對后的序列文件通過MEGA11軟件（https：//www.megas-oftware.net/dload_win_gui）構建系統發育進化樹，采用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）算法，Bootsrtrap參數重復1000次。

1.3森林草莓FveAHL保守結構域與理化性質分析

采用NCBI中CDD工具在線分析FveAHL家族成員的保守結構域，通過Weblogo（https：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）網站對結構域保守基序進行在線分析。應用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam）工具分析氨基酸數量、相對分子質量、等電點、不穩定指數等理化性質。利用WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預測蛋白質亞細胞定位。采用TBtools繪制基因在染色體上的分布圖及外顯子-內含子結構圖。利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析蛋白保守基序。

1.4森林草莓FveAHL啟動子順式元件與共線性分析

提取FveAHL家族成員ATG上游2000bp的序列作為啟動子序列，并使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）工具分析啟動子順式作用元件，通過TBtools進行可視化。利用TBtools軟件進行種內共線性分析。

1.5森林草莓FveAHL基因表達分析

基于已在線發表的森林草莓轉錄組數據庫，獲取草莓FveAHL基因的花藥組織表達數據，利用RPKM值計算樣本重復之間的均值，通過TBtools、AdobePhotoshopCC2019、AdobeIllustrator2020軟件進行數據可視化。

1.6亞細胞定位

根據森林草莓CDS文件，設計特異性引物，以森林草莓花藥cDNA為模板，PCR擴增FveTEK的CDS（去除終止密碼子），利用BP反應將CDS序列接入中間載體pDONR207中。使用上述構建完成的pDONR207載體，利用LR反應把目的基因置換到pEarleyGatel01載體上，轉化大腸桿菌L （DH5α） ，重組質粒測序正確后用于亞細胞定位試驗。本氏煙草瞬時轉化步驟：將農桿菌GV3101接種于含抗生素的LB培養基（ 28°C ， 200r/min ）至D₆₀₀=0.5～0.6 。離心收集菌體用侵染液（ 10mmol/L MgCl₂ ， 10mmol/L MES， 150μmol/L 乙酰丁香酮，pH5.6 ）重懸至 D₆₀₀=0.8～1.0 ，避光孵育 2～3h 將菌液注射至3～4周齡煙草葉片背面，完全浸潤。暗培養 12h 后轉至正常光照（ 22% ）， ^48h 后共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

1.7森林草莓穩定遺傳轉化

據報道，SRDX基序LDLDLELRLGFA能夠將轉錄激活因子轉化為強抑制因子[25-26]。設計合成SRDX結構域的單鏈DNA序列，進行退火： 98^qC 變性 3min ，以 0.1^qC/s 梯度降溫至 25°C ，產生雙鏈SRDX。SRDX序列末端包含AscI位點，用于將雙鏈SRDX序列同源重組克隆到 pCAMBIAI30O 載體中，獲得了pCAMBIA130O-SRDX融合載體。使用限制性內切酶XbaI和 SpeI 進行雙酶切，設計特異性引物（見表1），將目的基因插入到 pCAM. BIA1300-SRDX中，得到pCAMBIA1300-TEK-SRDX植物表達載體。使用農桿菌介導的穩定遺傳轉化驗證其功能。森林草莓的愈傷穩定遺傳方法參考課題組前期報道的試驗方法[27]。

1.8RNA提取和實時熒光定量PCR

草莓葉片總RNA提取使用諾唯贊多糖多酚植物組織總RNA提取試劑盒（RC411），具體步驟參考試劑盒說明書。cDNA合成所用試劑盒為Takara生物公司PrimeScriptTMRTreagentKit（PerfectRealTime）。根據TB G r e e n PremixExTaqTMI試劑盒進行實時熒光定量PCR。每個樣品設置三個技術重復，以 FveGAPDH 為內參基因，根據 2^-ΔΔCT 方法計算基因相對表達量，使用GraphPadPrism軟件繪圖。

1.9花粉生活力檢測

森林草莓花粉活力檢測使用I-KI溶液染色法。利用鑷子小心摘取轉基因植株與野生植株的花藥（開花1d后）。將單個花藥置于載玻片上，滴加一小滴蒸餾水。使用鑷子仔細地將花藥搗碎，確保花粉粒完全散出。接著，向其中加入1～2滴I-KI溶液，之后輕輕蓋上蓋玻片。在低倍顯微鏡下進行觀察記錄。凡是被I-KI溶液染成藍色的花粉粒，表明其含有淀粉且活力較強；而那些呈現黃褐色的花粉粒，則通常指示其發育不良。

2結果與分析

2.1FveAHL家族鑒定與系統發育分析

以擬南芥的AHL蛋白序列作為種子序列進行森林草莓基因組BLAST檢索，同時通過HMM搜索獲得初選序列，之后通過保守結構域分析，刪除冗余序列。共鑒定得到21條森林草莓FveAHL基因。根據它們在染色體上的分布，將得到的成員分別命名為FveAHL1～FveAHL21。

對已鑒定的FveAHL家族成員進行系統發育分析，結果如圖1所示，該家族聚類為兩個大分支（CladeA和CladeB）。FveAHL家族成員在兩個分支中的分布不均勻，CladeA由15個AtAHLs和11個FveAHLs組成，CladeB包括14個AtAHLs和10個FveAHLs。森林草莓與擬南芥AHL的密切系統發育關系表明同源基因可能具有相似的功能。

2.2FveAHL家族成員的理化性質分析

FveAHL的理化性質如表2所示，FveAHL家族編碼的蛋白長度從186aa到431aa不等，編碼區序列長度最短為 561bp ，最長為 1296bp 。FveAHL蛋白分子量在18791.44Da（FveAHL4）～47538.44Da（FveAHL2）之間，理論等電點（pI）在4.92～9.96之間，平均等電點為7.58。此外，多數蛋白質的等電點大于7，表明大多數FveAHL蛋白富含堿性氨基酸。FveAHL蛋白的不穩定系數在34.83～73.08之間，其中FveAHL15為穩定蛋白，其它均為不穩定蛋白。FveAHL的脂肪系數在57.13～86.2之間。只有FveAHL1、FveAHL4為疏水性蛋白，其它均為親水性蛋白。亞細胞定位預測結果如表3所示，大部分FveAHL家族蛋白定位細胞核中，少數定位在葉綠體和細胞質。

注：分支表示不同的進化分支，不同的顏色代表不同的物種。

Note：branches indicate different evolutionary branches，different colors represent different species.

Figure1Phylogenetic analysis of AHL gene families between Fragaria vesca and Arabidopsis

2.3FveAHL家族成員motif及基因結構分析

通過MEME網站預測FveAHL家族的保守基序，結果如圖2，FveAHL家族不同聚類組別之間motif差異較大。保守結構域分析表明，所有FveAHL家族成員均含有PPC保守域，而FveAHL9還具有一個PHA03247-superfamily保守域。基因結構分析結果表明，CladeA的FveAHL成員只含有一個1個外顯子，而CladeB含有5個外顯子。

2.4FveAHL家族成員啟動子順式元件分析

啟動子順式元件可與轉錄因子結合，通過調節基因表達來參與植物的生長、發育、防御和脅迫反應。所有FveAHL家族成員均含有啟動子核心基礎原件TATA-box和CAAT-box，此外，還包含以光響應、生長發育、非生物脅迫響應及植物激素調控元件為主的共53種順式作用元件。如圖3所示，大部分FveAHL家族成員均含有光響應元件，如，Box4、GT1基序、G-box、TCT基序、GATA基序等。G-box順式元件幾乎存在于所有FveAHL基因中，其中FveAHL13和FveAHL20數量最多，均含有6個。這表明FveAHL基因可能受光調控。大約 90.5% 的FveAHL家族成員含有厭氧誘導元件（ARE），其中FveAHL2、FveAHL6和FveAHL9數量最多，均含有6個。7種順式元件與激素反應相關，包括脫落酸（ABRE和TCA元件）、茉莉酸甲酯或MeJA（CGTCA基序、TGACG基序）和生長素（AuxRR核心、TGA元件和AuxRE）。此外，我們還發現 42.8% ！ 47.6% 和 52.4% 的FveAHL家族成員分別包含低溫響應元件（LTR）、干旱誘導元件（MBS）以及防御脅迫響應元件（富含TC序列），推測這些 FveAHL 基因在非生物脅迫的協調、發育和防御反應中發揮作用。

注：不同顏色代表不同顏色數量。

Note：different colors represent different color quantities.

2.5FveAHL家族成員的種內共線性分析

染色體定位結果（圖4）顯示，21個FveAHLs不均勻地分布在7條染色體上，最多的染色體是Fvb5號染色體，有8個FveAHL基因，最少的是Fvb2號和Fvb3號染色體，均只有2個FveAHL基因。基因復制是植物進化過程中基因家族成員擴張的最重要原因。進一步研究森林草莓FveAHL的基因復制事件，共線性分析結果表明共存在4個片段重復基因對。其中，FveAHL19和FveAHL6有共線性關系，FveAHL18與FveAHL5和FveAHL21分別具有共線性關系，而 FveAHL5 和 FveAHL2I 存在片段重復。

2.6FveAHL家族成員在不同組織表達分析

根據Li等[29]等發布的森林草莓不同組織轉錄組數據，提取FveAHL家族成員的RPKM值并繪制熱圖。如圖5所示，不同亞家族在不同部位組織表達水平存在差異。CladeA成員在各組織的表達量較CladeB成員的較低。FveAHL6、FveAHL8與FveAHL13主要在根部（root）表達，FveAHL16在9時期的花藥（anther）表達，和擬南芥雄性不育基因AtAHL16（TEK）同源。CladeB家族成員FveAHL4主要在花粉（pollen）和12時期的花藥（anther）表達。FveAHL5、FveAHL14與FveAHL7在森林草莓不同組織均有表達。

2.7FveTEK（FveAHL16）的克隆與分析

為了進一步研究FueTEK的功能，擴增獲得FveTEK基因長度為 801bp ，編碼266個氨基酸殘基。通過SMART數據庫分析鑒定FveTEK蛋白質的結構域，其在89～202aa處含有一個DUF296結構域（圖6a）。利用Expasy網站的ProtParam功能分析FveTEK基因編碼蛋白的理化性質，結果顯示FveTEK分子式為 C₁₂₁₆H₁₉₇₂N₃₆₂O₃₇₂S₁₀ ，相對分子質量27935.84Da，蛋白理論等電為9.27，脂肪系數為86.20，不穩定系數為40.41，總平均親水性為-0.182，說明FveTEK為不穩定的親水性蛋白（圖6b）。

利用SOPMA和SWISS-MOLD在線軟件預測FveTEK氨基酸序列的二級結構和三級結構，結果表明，FveTEK蛋白二級結構包含 α- 螺旋（Alphahelix）為 12aa ，占比為 4.51% ；延伸鏈（Extendedstrand）為51aa，占比為 19.17% ；無規則卷曲（Random coil）為 203aa ，占比為 76.32% （圖6c）；FveTEK蛋白質的三級結構表現出AHL家族蛋白的DUF296結構（圖6d）。此外，通過SignalP-5.0預測顯示FveTEK不含蛋白跨膜結構域和信號肽。

2.8FveTEK的亞細胞定位驗證

構建35S：FveTEK-GFP表達載體并轉化農桿菌，以35S：GFP為對照，分別瞬時轉化本氏煙草葉片細胞。激光共聚焦結果顯示，對照35S：GFP在細胞核和細胞質中均觀察到綠色熒光信號，而35S：FveTEK-GFP僅在細胞核觀察到綠色熒光信號（圖7）。結果表明，FveTEK屬于核定位蛋白，能夠特異性定位于細胞核內，這與其在其他物種中的同源蛋白定位結果一致，支持了FveTEK在細胞核內調控基因表達的可能性。

2.9FveTEK轉基因植株的鑒定

取各株系的幼嫩葉片，提取基因組DNA，設計潮霉素抗性基因（HygR）特異引物，PCR鑒定結果顯示，獲得6個FveTEK-SRDX陽性株系，編號分別為FveTEK-SRDX-1～6（圖8a）。進一步檢測轉基因植株的FveTEK表達水平，qRT-PCR結果顯示（圖8b）：FveTEK在6株轉基因植株中均顯著下調表達，是WT的0.09～0.6倍，其中FveTEK-SRDX-3和FveTEK-SRDX-4的FveTEK表達下調最大，是WT的0.09倍，其次，是FveTEK-SRDX-6的，為WT的0.6倍。基于上述結果，選取表達下調最大的兩個株系（FveTEK-SRDX-3和FveTEK-SRDX-4）用于后續試驗。

注：a，FveTEK蛋白結構域；b，FveTEK氨基酸親疏水性；c，FveTEK蛋白二級結構；d，FveTEK蛋白三級結構。 Note：a，FveTEKproteindomain;bFveTEKaminocidhdrophilic；c，econdarystructureofFeTEKprotein；dtertiarysrctuef FveTEK protein.

2.10FveTEK-SRDX株系花粉生活力測定

為探究FveTEK-SRDX株系自花授粉后花托無法正常膨大的原因，分別取野生型H4和FveTEK-SRDX株系的成熟花粉粒進行L-KI染色觀察（圖9a）。結果顯示，FveTEK-SRDX株系的大部分花粉外觀畸形，無法著色，喪失活性。經統計，FveTEK-SRDX株系的花粉活性率在 30%～50% 之間。與野生型（ 71% ）相比，FveTEK-SRDX-3和FveTEK-SRDX-4的花粉活力分別下降了 26% 和37% （圖9b）。該結果表明可能是FveTEK-SRDX株系的花粉發育不良，導致自花授粉的花托無法正常膨大，出現畸形果。

注：a，FveTEK轉基因植株的PCR鑒定;M，marker;W，野生型（WT），陰性對照;P，陽性對照; b，qRT-PCR 檢測 FveTEK 在 FveTEK-SRDX株系中的表達水平。 ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ***Plt;0.001 □ Note：a，PCRdetectionofFeTEKtransgenicplants；M，marker；W，wildtype（WT）asnegativecontrol;P，positivecontrol;bRPCR was used to detect the expression level of FveTEK in transgenic plants. ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^****Plt;0.001

注：a，FveTEK-SRDX株系花粉 I₂ -KI染色， _bar=100μm;b ， FveTEK轉基因植株花粉活性統計。 ^*Plt;0.05 ， ^**Plt;0.01 ***Plt;0.001 。 Note：a，FveTEK transgenic plant pollen was stained with I₂-KI ba Δur=100μm ；b，statistics onpollenactivityofFveTEK-SRDX transgenic plants. ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ^***Plt;0.001 ：

3小結與討論

對擬南芥的研究表明，AHL蛋白通過PPC/DUF296結構域形成同源二聚體或異源二聚體，同時通過AT鉤結構域與雙鏈DNA的AT堿基豐富區域結合，召集轉錄因子參與基因轉錄調控[9]。系統發育分析將21個FveAHL蛋白分為兩個進化分支，進一步分析發現，兩個分支的成員在AT-hook基序的數量或序列特征上存在顯著差異，提示AT-hook基序可能對FveAHL的功能分化具有重要作用。此外，在系統發育樹分析中歸類為CladeA的FveAHL成員具有相似的外顯子/內含子組成，表明每個亞家族的結構相對保守。在大豆和玉米中，AHL蛋白存在于多個細胞器中，包括細胞核、細胞質和葉綠體[8-9]。森林草莓也發現相似結果，而蛋白在細胞中的分布部位往往與它們的生物功能相適應，這表明AHLs的亞細胞定位在各種物種中是保守的。

已報道AHL家族多數成員參與調控植物對非生物脅迫的響應[30-32]。啟動子中的順式元件被認為會影響植物的生長、發育和脅迫反應[33，34]。分析FveAHL啟動子的順式作用元件有利于了解其潛在的生物學功能。大多數FveAHL含有厭氧誘導元件，并具有ABA、MeJA和生長素響應元件。此外，森林草莓所有FveAHL啟動子均含有光響應元件，推測它們都響應光信號。一些FveAHL成員還含有低溫和干旱脅迫響應元件。在對葡萄和大豆AHL的研究中，所有AHL基因啟動子也都包含光反應元件、激素反應元件和非生物脅迫響應元件[9，35]。這表明森林草莓和其他植物物種中的AHL基因在功能上具有相似性，參與植物的生長、發育和脅迫響應。AHL家族廣泛分布在植物中，在調節花、下胚軸、根和葉發育中起著至關重要的作用[35-38]。為了更好地解析FveAHL在森林草莓中的具體表達模式，我們分析了21個FveAHL在不同組織中的相對表達水平。AHL3、AHL4、AHL18和OsAHL1調節根的發育[20]。DP1、AHL16/TEK、AHL21/GIK、Baf1調節各種花器官的發育[37，39-40]。這些結果表明，FveAHL在森林草莓植株花和主根的發育中起著至關重要的作用。

花粉壁包括由外膜和內膜兩層。內層的結構與普通細胞壁相似，主要成分是纖維素、半纖維素和果膠，而外層則由孢粉素組成，來源于絨氈層細胞的分泌作用，具有很強的抗機械和化學損傷能力[41]。TEK在四分體時期的絨氈層高表達，是花粉壁外膜形成過程中的重要調節基因。擬南芥tek敲除突變體的花粉沒有外膜層，也會導致內膜結構的塌陷，表現為雄性不育[22]。因此，正確的內膜形成取決于內基層的存在。在水稻中，ptc2（PERSISTENTTAPETALCELLS2）敲除突變體觀察到與tek相似的花粉外壁缺陷表型。此外，ptc2在小孢子形成過程中絨氈層的降解被抑制，無法為花粉小孢子的發育提供營養。在水稻中，PTC2基因屬于AHL基因家族，其在擬南芥中最接近的同源基因是AtAHL19和AtAHL20[18]。ptc2花粉壁中角質層沉積的改變可能是由孢粉素生物合成酶缺陷引起的[18]。本研究通過森林草莓遺傳轉化構建 FveTEK-SRDX 顯性抑制表達株系，結果表明 FveTEK 基因下調表達可以誘發森林草莓花粉粒敗育。此外，還構建了CRISPR/Cas9基因敲除植株，但PCR鑒定其靶點位置無任何點位突變，后續研究可以建立敲除體系驗證FveTEK突變體功能。

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