同型半胱氨酸誘導人血管平滑肌細胞氧化損傷的研究

蘇　娟　王樹人　吳建新　秦　燕

【摘要】 目的 探討同型半胱氨酸(Hcy)對人臍靜脈血管平滑肌細胞(VSMCs)氧化損傷的作用及機制。方法 用含不同劑量Hcy（50~1000 μmol/L）的培養基培養VSMCs 24 h后，以分光光度比色法分別測定細胞內丙二醛(MDA)含量和超氧化物酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力的改變。結果 隨Hcy濃度增加，VSMCs內MDA的含量明顯增加，SOD和CAT的活力也顯著升高。Hcy明顯促進了VSMCs的氧化。結論 Hcy可直接誘導VSMCs的氧化損傷。

【關鍵詞】 同型半胱氨酸；平滑肌細胞；氧化損傷

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是近年來確定的致動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的新的獨立的危險因子［1］。研究顯示，Hcy含有巰基(-SH)，易發生自身氧化，可生成如超氧化物、過氧化氫和羥自由基等多種強氧化物，啟動脂質過氧化鏈式反應而損傷細胞［2］。Hcy對細胞的氧化作用，以往的研究主要集中在血管內皮細胞上。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) 也是As發生的主要效應細胞，Hcy對其是否有氧化作用卻少見報道。本研究旨在探討Hcy對VSMCs的氧化作用及機制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑 DMEM/F12培養基(Gibco)、新生牛血清（杭州四季清）、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、D-Hanks液；同型半胱氨酸 (Sigma)；MDA、SOD、CAT測定試劑盒（南京建成）。

1.2 人VSMCs的體外培養、鑒定與分組 采用組織貼塊法培養。取無菌的新鮮的人臍帶，剪取臍靜脈血管中膜部分并剪成約(0.5 mm×1 mm×1 mm~1.0 mm×1 mm×1 mm大小的血管小塊，以每3~5 mm2塊密度均勻種植于培養瓶底。采用DMEM/F12培養液，在37℃、5%CO₂培養箱（濕度100%）內靜置進行原代培養和傳代培養。在倒置顯微鏡下進行觀察，并做α-actin肌動蛋白免疫組化檢測。取3~6代細胞用于實驗。將細胞分別置于終濃度為0、50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy的培養液中孵育24 h，每組重復做5次。

1.3 方法 細胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，2000轉/min離心5 min，棄上清液。加入無菌的三蒸水，采用反復凍融法裂解細胞。取上清液按說明書，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定細胞內丙二醛（MDA）的含量，黃嘌呤氧化法比色測定細胞內超氧化物岐化酶（SOD）的活力，可見光法測定細胞內過氧化氫（CAT）的活力。

1.4 統計學方法 所有數據用（x±s）表示，進行t檢驗。采用SPSS 13.0軟件操作，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞內丙二醛（MDA）的含量 由表1可見：VSMCs內MDA的含量隨Hcy濃度的增加而增加，當Hcy濃度達到 500 μmol/L以上與對照組有顯著差異性。

2.2 細胞內超氧化物岐化酶（SOD）的活力 在Hcy作用下，VSMCs內SOD的活力明顯升高，在低濃度（50 μmol/L）時就與對照組有差異性，并呈濃度依賴性升高。

2.3 細胞內過氧化氫（CAT）的活力 VSMCs內CAT活力也隨著Hcy濃度的增加而增加，但在高濃度（1000 μmol/L）時才與對照組顯示出差異性。

3 討論

Hcy是體內蛋氨酸在代謝過程中經脫甲基等一系列反應形成的一種含硫氨基酸，在體內含量極少。在正常成人體內，血漿Hcy濃度大約為5~15 μmol/L。血漿中Hcy濃度>15 μmol/L稱為高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteine,HHcy)。1969年，McCully發現由于維生素B12的代謝障礙以及胱硫醚-β-合成酶(CβS)缺陷均可導致HHcy和類似As的病變；隨后他又通過動物模型證實Hcy在血中蓄積可導致類似As的血管病變。據此，McCully提出HHcy與As有關的假說［3］。近年大量的回顧性、前瞻性和實驗性研究已確定，血漿中Hcy水平升高是As發病的一個新的獨立的危險因素［4］。

Hcy誘發As的機制相當復雜，目前尚未完全明了，研究認為與氧化損傷、細胞凋亡、炎癥反應、凝血纖溶異常等作用有關［5］。其中，氧化損傷作用一直是Hcy引發As的研究重點。Tyagi等研究發現，Hcy在過渡金屬離子（Fe³⁺、Cu²⁺）的存在下易發生自身氧化，生成多種強氧化產物如超氧化物（O^-₂?）、過氧化氫（H₂O₂）和羥自由基（?OH）等，產生氧化應激反應，啟動膜脂質過氧化鏈式反應，降低膜流動性并破壞細胞的完整性，導致細胞功能改變，甚至壞死脫落［6］。高鍵等研究顯示，Hcy可促進內皮細胞內活性氧的生成，使血管內皮細胞處于一種氧化應激狀態，進而使血管內皮細胞出現結構和功能上的損害。Hcy通過氧化損傷造成血管內皮細胞損害可能是HHcy導致As的始動環節 ［7］。血管平滑肌細胞（VSMCs）也是As發生的主要效應細胞。VSMCs的增殖、炎癥反應、凋亡等病理變化也參與了As病程的發生和發展。本研究結果顯示，在Hcy作用下，VSMCs內MDA的含量明顯增加，與對照組比較有顯著性差異。MDA是脂質過氧化的產物，其含量能直接反映脂質過氧化的速率和強度。說明Hcy也可以直接引發VSMCs發生脂質過氧化反應，從而使VSMCs出現氧化損傷。

本研究結果還顯示，在Hcy作用下，VSMCs內SOD和CAT的活力明顯升高。SOD和CAT為體內活性氧的清除劑。SOD可催化O^-₂?生成H₂O₂,H₂O₂在CAT作用下生成H₂O，從而消除自由基的毒性作用。本研究認為，SOD和CAT活力的升高對Hcy促VSMCs的氧化作用應該是一種代償反應。Moat等報道，HHcy患者血液中SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性是升高的［8］。本研究發現，小劑量（50 μmol/L）Hcy作用下細胞內主要的抗氧化酶（SOD）的活力就有了明顯改變，提示低濃度的Hcy就可促使VSMCs內活性氧生成。而在高濃度（500~1000 μmol/L）Hcy作用下活性氧增多顯著，SOD和CAT活力的增高雖可拮抗活性氧的作用，但VSMCs內脂質過氧化反應明顯，故MDA含量顯著升高，Hcy誘發VSMCs出現了明顯的氧化損傷，該作用可能也參與了HHcy致As的發生和發展過程。

參 考 文 獻

［1］ Guthikonda S,Haynes WG.Homocysteine:role and implications in atherosclerosis.Cur Athero Rep,2006,8(2):100-106.

［2］ Perez AK,Foncea R,Leighton F.Reactive oxygen species mediates homocysteine-induced mitochondrial biogenesis in human endothelial cells:modulation by antioxidants.Biochemical,2005,338(2):1103-1109.

［3］ Turhan H,Erbay AR.Plasma homocysteine levels in patients with isolated coronary arteryectasia.Int J Cardiol,2005,104(2):158-162.

［4］ Stazka J,Luchowski P,Urbanska EM.Homocysteine,a risk factor for atherosclerosis,biphasically changes the endothelial production of kynurenic acid.Euro Pharm,2005,517(3):217-223.

［5］ LENTZ S R.Mechanism of homocysteine induced atherothrombosis.Thromb,2005,3(8):1646-1654.

［6］ Tyagi N,Sedoris KC,Steed M,at al.Mechanisms of homocysteine-induced oxidative stress. Cir Physiology,2005,289(6):2649-2656.

［7］ 高鍵,薛安娜.同型半胱氨酸誘導ECV304細胞氧化損傷研究.衛生研究,2003,32(1):20-21.

［8］ Moat SJ,Bonham JR,Cragg RA.Elevated plasma homocysteine elicits an increase in antioxidant enayme activity.Free Rad Res,2000,32(2):171-179.