阿托伐他汀對糖尿病腎病大鼠腎小球細胞增殖的影響及其意義

尤燕舞 林栩 楊發奮 王潔

【摘要】 目的 探討阿托伐他汀對糖尿病腎病大鼠腎小球細胞增殖的影響及意義。方法 將40只SD雌性大鼠隨機分為四組：糖尿病腎病組（DN組）、預防組、治療組、對照組，每組10只。DN組、預防組和治療組糖尿病造模成功后，預防組和治療組分別給予不同劑量的阿托伐他汀干預，對照組僅注射檸檬酸緩沖液。第8周測定相關生化指標，觀察腎組織病理改變后，通過免疫組化法分析大鼠腎小球增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）的表達。結果 預防組和治療組相關生化指標較DN組好轉，腎臟病變減輕，PCNA表達于腎小球固有細胞。DN組腎小球中PCNA的表達均較預防組、治療組、對照組明顯上調。而預防組、治療組腎小球中PCNA的表達較DN組下調，且預防組PCNA的下調更為顯著。結論 阿托伐他汀通過下調腎小球PCNA表達，抑制腎小球細胞增殖實現對DN的保護作用。

【關鍵詞】 阿托伐他汀；糖尿病腎病；腎小球；細胞增殖

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的嚴重并發癥，最終進展至慢性腎功能衰竭，也是導致糖尿病患者死亡的常見原因。因此，對DN的早期治療以延緩慢性腎臟病的進展成為臨床上需要迫切解決的關鍵問題。阿托伐他汀是以氟苯取代吲哚環的甲羥戊酸內酯的衍生物，是全人工合成的第2個他汀類藥物，無需代謝轉化就具有藥理活性。近年研究發現他汀類藥物的腎保護作用可能材料與方法

1.糖尿病腎病大鼠模型的建立 清潔級SD雌性大鼠40只購自廣西醫科大學，體重在200～250 g之間，采用隨機原則分為四組：糖尿病腎病組（DN組）、預防組、治療組和對照組，每組10只。大鼠在SPF級清潔條件下飼養。DN組、預防組和治療組均單次左下腹腔注射50 mg/kg的鏈尿佐菌素（STZ），注射后連續三天采集尾靜脈血測血糖濃度，若血糖>16.7 mmol/L說明糖尿病造模成功。預防組于造模成功后每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；治療組于造模成功后收集24小時尿測定尿蛋白，出現明顯蛋白尿（即第4周）起每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃；對照組僅予注射pH=4.5的檸檬酸緩沖液。

2.標本收集 第8周用代謝籠收集大鼠24小時尿液以測定尿白蛋白排泄率（Urinary Albumin Excretion Rate，UAER），麻醉方式采用乙醚吸入，經心臟取血，離心取血清用以測定血膽固醇（CHO）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），計算內生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate，Ccr）；切下腎臟，分離包膜后用10%甲醛浸泡固定，制作石蠟塊，以行常規染色、免疫組化等檢測。

3.光鏡下分析腎臟病理改變 腎組織蠟塊行3 mm切片后行HE、PAS染色，于光鏡下用彩色病理圖像分析系統分析腎臟病理改變。

4.免疫組化檢測 采用免疫組織化學SP法，3 mm切片用血清封閉，依次滴加一抗為兔來源的多克隆增殖細胞核抗原（PCNA）、生物素標記的羊抗兔IgG、辣根酶標記的鏈酶卵白素液等，PBS替代一抗作陰性對照。DAB染色后于光鏡下用彩色病理圖像分析系統分析其陽性表達情況，于高倍鏡下（400倍）每張切片連續取10個腎小球分析腎小球陽性區域的灰度值并計算陽性細胞數。

5.統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（-±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用q檢驗（Newmankeuls法），P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.生化指標 DN組大鼠血糖、24小時UAER、血膽固醇、內生肌酐清除率、尿素氮水平均較對照組明顯升高（P均<0.01）。而預防組和治療組的以上指標均較DN組降低（P<0.05或0.01），其中預防組的UAER降低較治療組更為明顯（P<0.05）。

2.光鏡下腎臟病理改變 糖尿病腎病大鼠腎組織表現為以系膜細胞為主的腎固有細胞中、重度增生，系膜區基質增生，系膜區擴大，基底膜增厚，腎小球體積明顯增大等改變。預防組和治療組的上述病理改變較DN組減輕。

3.腎小球中PCNA的表達 PCNA主要表達于腎小球固有細胞的細胞核。在DN組腎小球中PCNA的表達水平（0.45±0.02）均較預防組（0.23±003）、治療組（0.36±0.02）、對照組（0.15±0.02）明顯上調（P<0.05）。而預防組、治療組大鼠腎組織中PCNA的表達水平較DN組下調（P<0.05），其中預防組大鼠腎組織中PCNA的表達水平又較治療組下調（P<0.05）。

討 論

DN是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，是引起我國慢性腎功能衰竭常見的病因，病情復雜、預后不良，是臨床治療上較為棘手的疾病。因此，尋找有效的藥物用于糖尿病腎病的早期治療非常重要。阿托伐他汀為HMGCoA還原酶選擇性抑制劑，可顯著改善內皮功能，改善腎功能，其作用是通過非降脂依賴性機制，而且效果與劑量相關[1]。幾項臨床研究證實阿托伐他汀可在糖尿病腎病患者中發揮治療作用[2～4]，但其作用機制尚不明確。增殖細胞核抗原（PCNA）是調節細胞增殖的關鍵因子，其在靜止期細胞中表達很少，在G晚期開始增高，通常在S期達高峰，到M期則開始明顯下降，其作為DNA聚合酶6的輔因子，參與調節DNA合成，與細胞增殖密切相關，是評價細胞增殖活性的可靠指標。劉靜等人[5]在糖尿病腎病大鼠腎組織中檢測PCNA的表達，發現PCNA顯著高于對照組，因此認為其在糖尿病腎病的發生、進展中起著重要作用。我們前期已經證實，調節細胞增殖的關鍵因子——細胞周期素和周期素依賴性激酶參與了糖尿病腎病中腎固有細胞的增殖，說明細胞增殖在糖尿病腎病的發生、進展中起著重要作用[6]。

本文通過對大鼠腹腔注射STZ成功制備了糖尿病模型，分別在糖尿病早期未出現腎臟病變時和合并腎病后給予阿托伐他汀治療，觀察阿托伐他汀預防用藥和治療用藥后相關生化指標、腎臟病理改變及腎小球中PCNA的表達變化，以探討阿托伐他汀對DN的預防和保護作用及其通過影響細胞增殖發揮的非依賴降脂作用機制。第8周大鼠腎組織符合DN病理表現，血糖、膽固醇明顯升高，出現蛋白尿，腎功能出現損害，腎小球中細胞增殖的同時PCNA的表達明顯上調。給予阿托伐他汀治療后腎臟病變減輕，血糖、膽固醇下降，蛋白尿、腎功能損害減輕，腎小球中PCNA的表達減少，且早期預防用藥對減少蛋白尿和下調腎小球中PCNA表達的作用較治療用藥更為顯著。由此說明阿托伐他汀對DN具有保護作用，其作用機制部分是通過下調腎小球PCNA表達，抑制細胞腎小球細胞增殖而實現的，早期用藥效果更佳。

綜上所述，阿托伐他汀通過下調腎小球PCNA表達，抑制細胞腎小球細胞增殖實現對DN的保護作用。但阿托伐他汀在DN治療中可能還存在其他作用機制，如對增殖以外的細胞周期等的影響還有待于進一步研究。

參考文獻

[1]Shepherd J，Kastelein JJ，Bittner V，et al.Effect of intensive lipid lowering with atorvastatin on renal function in patients with coronary heart disease： the Treating to New Targets （TNT） study[J].Clin J Am Soc Nephrol，2007，2（6）：11311139.

[2]周 利，賀祿碧.前列地爾聯合阿托伐他汀治療早期糖尿病腎病療效觀察[J].中國醫藥導刊，2012，14（4）：649650.

[3]吳志堅.阿托伐他汀聯合替米沙坦防治早期糖尿病腎病的療效觀察[J].中國當代醫藥，2012，19（2）：5556.

[4]鐘 誠，徐 耕，金紅峰，等.阿托伐他汀對冠心病伴糖尿病患者的腎臟保護作用的臨床觀察[J].心腦血管病防治，2012，12（2）： 97100.

[5]劉 靜，陳昕麗，竇玉娟，等.增殖細胞核抗原在實驗性糖尿病腎病大鼠腎組織表達中的意義[J].華北煤碳醫學院學報， 2011， 13（2）： 162163.

[6]尤燕舞，林 栩，楊發奮，等.糖尿病腎病大鼠腎組織周期素D1與周期素依賴性激酶4的表達及意義[J].右江醫學，2008，36（3）： 245247.