氨甲喋呤對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖和膠原合成的影響

張建軍　陳發國　吳毅平

[摘要]目的：探討氨甲喋呤對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖和膠原合成的影響。方法：以體外培養的人瘢痕成纖維細胞為實驗模型，將氨甲喋呤（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L）加入細胞培養液中進行干預并與空白對照組比較，用乳酸脫氫酶實驗檢測藥物的細胞毒性，并通過MTT實驗和羥脯氨酸測定實驗分別檢測藥物對成纖維細胞增殖活性和膠原合成的影響。結果：10-6mol/L、10-5mol/L的氨甲喋呤對成纖維細胞的生長有抑制作用，與對照組比較差異有顯著性（P<0.01），10-9mol/L～10-5mol/L的氨甲喋呤對瘢痕成纖維細胞膠原合成具有抑制作用（P<0.01）。結論：氨甲喋呤在體外對瘢痕成纖維細胞細胞增殖和膠原合成具有抑制作用。

[關鍵詞]氨甲喋呤；增生性瘢痕；成纖維細胞；細胞增殖；膠原合成

[中圖分類號]R619+.6[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）11-1961-03

增生性瘢痕是多種致傷因素對真皮組織作用后創面異常愈合的不良結局，不僅可伴有疼痛、瘙癢等不適癥狀，過度的增生還可以造成機體外形改變和功能障礙，進而影響患者的生活質量，對患者生理和心理造成損害，臨床治療效果目前多不令人滿意[1]，如何防治瘢痕的形成，一直是近年來的研究熱點之一。病理性瘢痕的形成機制異常復雜，已有的研究提示[2]：它是一個多種因素作用下的纖維化過程，其中（肌）成纖維細胞的異常增殖以及其膠原的過度合成在其中發揮了重要的作用，已成為人們選擇治療的重要靶點。因此，從抑制成纖維細胞增殖和膠原代謝的方面尋找治療和預防瘢痕增生藥物具有重要意義。氨甲喋呤具有抗增殖和免疫抑制的雙重藥理作用，在對纖維化皮膚病諸如侵襲性纖維瘤[3]的治療中也發揮了一定的治療作用。我們通過以體外培養的增生性瘢痕成纖維細胞作為實驗對象，觀察氨甲喋呤對瘢痕成纖維細胞增殖及膠原合成的影響，為探討氨甲喋呤在治療增生性瘢痕方面的臨床應用價值提供實驗和理論依據。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗藥物：氨甲喋呤：DMEM溶解后濾過除菌（0.2μm濾膜），配制成10-3mol/L濃度母液，置-20℃冰箱避光保存，貯存備用。臨用時用無血清DMEM分別稀釋成0、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L[4]。

1.1.2主要儀器和試劑：DMEM：美國Gibco公司；MTT、胰蛋白酶：華美公司；小牛血清：浙江三立公司；DMSO上海Sangon公司；羥脯氨酸試劑盒：南京建成生物制品有限公司。OLYMPUS-IX71型倒置相差顯微鏡（日本）、Form Scientific CO2孵箱（美國）、BIO-RAD550型酶聯免疫檢測儀（美國）、HITACHI7176S型全自動生化分析儀（日本）、TU-1800紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.1.3標本來源：增生性瘢痕成纖維細胞來源于手術中切下的增生性瘢痕，共3例（女2，男1）， 年齡1～25歲，取材部位分別為手部、頸部、髂腰部，病程分別為10個月、12個月、13個月，近期無使用瘢痕治療藥物史，不伴有腫瘤或其它嚴重疾病。

1.2 實驗方法

1.2.1人成纖維細胞培養：用組織塊法[5]進行成纖維細胞培養：無菌條件下進行漂洗、剪碎，接種于含10%新生牛血清（NCS）的DMEM培養液中，在37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2孵箱中培養。待細胞從組織塊中長出并接近融合成單層時用0.125% 胰蛋白酶消化， 1： 2 傳代。本實驗所用細胞為4～6代。實驗按照藥物濃度分為空白對照組0（為不含藥物的DMEM培養液）和實驗組：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L。

1.2.2 乳酸脫氫酶（LDH） 的測定：取4～8代對數生長期細胞，血細胞計數板計數，用含10%NCS的DMEM培養液調整細胞密度為2.5×104/ml，用24孔培養板培養，每孔接種1ml即2.5×104個細胞，置CO2孵箱內培養24h，每一藥物濃度組及相應對照組均設6個復孔，按實驗藥物分組加入條件培養液1ml，繼續培養24h，取上清，用全自動生化分析儀測定LDH活性值。

1.2.3 MTT比色法測定細胞增殖狀況：MTT法參照Hansen[6]的方法略作修改，取4～8代對數生長期細胞，血細胞計數板計數，用含10%NCS的DMEM培養液調整細胞密度為5×104/ml，用96孔板培養，每孔加入100μl即5×103個細胞，置CO2孵箱中培養24h，吸棄上清，每一藥物濃度組及相應對照組均設8個復孔，2個無細胞對照孔，按實驗藥物分組加入條件培養液100μl，繼續培養24h，吸棄上清10μl加入MTT液10μl/孔（MTT5g/L）繼續培養4h，棄上清，每孔加入DMSO100μl，振蕩10min，使結晶充分溶解，自動酶聯免疫分析儀測定吸光度A（波長570nm）。

1.2.4 細胞分泌膠原含量的測定[7]：將細胞接種于24孔培養板，細胞密度5×104/ml，每孔加入1ml培養基，接種48h后更換條件培養液，每一藥物濃度組設計6個復孔。藥物作用48h，從每孔各吸取0.5ml培養基，按羥脯氨酸（HPr）檢測試劑盒說明書方法，測定培養基中HPr含量。用紫外可見分光光度計550 nm檢測培養基中A值，測定HPr的含量，樣品中HPr的質量濃度（μg/ml）=（（測定管A值-空白管A值）/（標準液A值-空白管A值））×標準管質量濃度（2μg/ml）；樣品中膠原的濃度（μg/ml培養基）=樣品中羥脯氨酸濃度×7.46×稀釋倍數（7.46是從羥脯氨酸換算為膠原時的計算常數）。

1.3 統計學處理：采用SPSS18.0統計軟件進行多個實驗組與同一對照組的比較的方差分析，數據用x±s表示，P<0.05示差異有顯著性。

2結果

2.1 藥物對細胞的毒性作用：氨甲喋呤作用24h后，10-9mol/L、10-8mol/L濃度氨甲喋呤培養上清中LDH活性與對照組比較差異均無顯著性（P>0.05）；而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L濃度氨甲喋呤與空白對照組比較，結果差異均有顯著性 （P<0.01）（見表1）。提示：高于10-7mol/L濃度的氨甲喋呤均表現出對增生性瘢痕成纖維細胞的細胞毒性作用。

2.2 藥物對細胞增殖的影響：10-6mol/L、10-5mol/L濃度氨甲喋呤藥物組分別與空白對照組比較差異均有顯著性（P=0.000），而10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L濃度氨甲喋呤藥物組分別與對照組比較差異均無顯著性（P>0.05）（見表2）。提示：高于10-6mol/L濃度的氨甲喋呤能顯著抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖，而低于10-6mol/L濃度的氨甲喋呤卻未表現出此抑制作用。

2.3 藥物對瘢痕成纖維細胞膠原合成的影響：各濃度氨甲喋呤藥物組與空白對照組之間差異均有顯著性（P<0.01）（見表3）。提示：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L濃度的氨甲喋呤均抑制了增生性瘢痕成纖維細胞膠原蛋白的合成。

3 討論

成纖維細胞在瘢痕形成過程中起著至關重要的作用，它是形成肉芽組織、合成膠原等細胞外基質、進行傷口重塑的重要細胞[2，8]，成纖維細胞的異常增殖和過度合成或分泌膠原蛋白的功能受到普遍關注。

氨甲喋呤對增生性瘢痕中成纖維細胞是否有直接作用，目前還尚未見到文獻報道。MTT法是目前常用的檢測細胞增殖和活力的方法，可以通過吸光度值的高低反映活性細胞的濃度。本試驗MTT比色法結果顯示10-6mol/L、10-5mol/L濃度藥物組的吸光度值較對照組有一定程度的下降，與對照組有顯著性差異（P<0.01），提示10-6mol/L、10-5mol/L濃度的氨甲喋呤對成纖維細胞的增殖有一定的抑制作用，這與安振梅報道的氨甲喋呤對人眼球后成纖維細胞增殖的抑制作用結果基本一致[9]。

乳酸脫氫酶是所有細胞的胞漿內均存在的細胞內酶，細胞膜受損時可迅速釋放到細胞外，故可作為細胞毒性檢測的一項敏感指標。我們測定了細胞上清液中的LDH值，結果氨甲喋呤作用24h后，10-9mol/L、10-8mol/L濃度氨甲喋呤培養上清中LDH活性與對照組比較差異均無顯著性（P>0.05）；而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L濃度氨甲喋呤與空白對照組比較，結果差異均有顯著性（P<0.01）（見表1）。提示：高于10-7mol/L濃度的氨甲喋呤均可能損傷了部分瘢痕成纖維細胞的細胞膜，而表現出其細胞毒性作用。

羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸，含量相對恒定，占膠原中總氨基酸的13.4%，而一般蛋白質含量極微，故羥脯氨酸的測定值可間接反映膠原蛋白的合成情況。我們的實驗檢測了細胞上清液[7]中的羥脯氨酸的含量，結果顯示：在本實驗條件下，10-9mol/L～10-5mol/L濃度的氨甲喋呤可使細胞上清液中的羥脯氨酸含量顯著降低（P<0.01），據此計算出的膠原蛋白含量，與對照組相比呈顯著性降低（P<0.01），這間接反映出對增生性瘢痕成纖維細胞的膠原合成的抑制作用。另外，在本實驗結果中10-9mol/L～10-7mol/L濃度的氨甲喋呤雖然并未表現出對成纖維細胞的抑制作用，但卻抑制了膠原的合成，也提示氨甲喋呤可能存在的臨床應用前景。

氨甲喋呤是一種有效的抗腫瘤藥物，它是二氫葉酸還原酶抑制劑，可阻止二氫葉酸向四氫葉酸轉化，使細胞DNA合成障礙，干擾RNA和蛋白質的生物合成，其主要作用于S期細胞，尤其對于處于對數增殖期的細胞作用最強，我們選取的瘢痕成纖維細胞處于增殖旺盛的對數生長期，體外實驗中氨甲喋呤對增生性瘢痕成纖維細胞的增殖和膠原合成的抑制作用機制可能與此有關。另外，氨甲喋呤對細胞增殖的調控也可通過誘導細胞凋亡發揮作用[4]，我們通過MTT、LDH測定實驗結合顯微鏡下觀察發現，10-6mol/L、10-5mol/L濃度的氨甲喋呤影響了細胞的活性，對部分細胞的細胞膜產生了損傷，但這部分成纖維細胞究竟是發生了壞死還是凋亡目前還不清楚，需要通過進一步實驗來確定。

氨甲喋呤被用于兒童并指畸形術后瘢痕疙瘩的預防和治療，療效滿意[10]，但未見到氨甲喋呤治療增生性瘢痕的報道。結合本實驗結果，氨甲喋呤雖然在體外可抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖和膠原合成，臨床治療瘢痕疙瘩也發揮了治療作用，但其潛在的治療增生性瘢痕的作用可能會由于它的細胞毒性作用而受到一定的限制。

氨甲喋呤作為一種免疫抑制劑，臨床用于治療硬皮病[3，11]、難治性的牛皮癬、結節病和類風濕關節炎[12]。瘢痕增生過程中局部免疫反應活躍，氨甲喋呤是否可通過抑制局部增強的免疫反應來間接調控增生性瘢痕成纖維細胞增殖和膠原合成，促進瘢痕的消退，需要今后的實驗去證實。

本實驗結果提示，氨甲喋呤一方面可直接抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖，另一方面可減少膠原蛋白的生成。因此可以推測該藥在防治增生性瘢痕方面可能具有潛在的應用價值。

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[收稿日期]2012-07-26[修回日期]2012-10-15

編輯/張惠娟