骨髓間充質干細胞膜片的體外構建及成骨分化實驗研究

張蓉　鄧煒焯　郭增良　高瞻

[摘要] 目的：探索骨髓間充質干細胞膜片的體外構建簡便方法，并評估其成骨分化潛能。方法：將兔骨髓間充質干細胞高密度接種，在成骨誘導條件下連續培養形成細胞膜片。通過組織學、堿性磷酸酶活性定量檢測、透射電鏡和掃描電鏡等方法，檢測細胞膜片的特性。結果：高密度連續培養及成骨誘導后形成骨髓間充質干細胞膜片。HE染色證實膜片是一種由多層細胞和細胞外基質組成的聚集體；茜素紅染色呈陽性；堿性磷酸酶定量分析含量較高；掃描電鏡及透射電鏡檢查均見基質中大量的礦化結節聚集。結論：通過體外簡單的連續培養和成骨誘導后，可形成具有良好成骨能力的骨髓間充質干細胞膜片。

[關鍵詞]間充質干細胞；細胞膜片；成骨分化

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

組織工程技術的出現和興起標志著再造時代的來臨，傳統的基于細胞的骨組織工程，是利用大量的種子細胞種植在支架材料上，通過活性因子等誘導細胞分化成骨[1]。但研究發現該方法存在一些缺點，如細胞利用率低、附著效率差； 細胞在支架材料上分布不均；常用的蛋白酶消化收集細胞的方法，會改變細胞的表型和生化成分。并且，培養過程中細胞分泌的細胞外基質及形成的細胞間連接蛋白也常被破壞[2]。目前這些問題一直未能圓滿解決，已成為限制骨組織工程技術應用于臨床的瓶頸。

1993年日本學者Okano等[3]首先報道將聚N-異丙基丙烯酰胺應用到細胞培養上，創新性地發明了細胞膜片技術。應用特殊的外源性溫敏聚合物材料提取完整的細胞聚集體，用于組織工程構建。該技術借助細胞間的連接以片狀形式脫附，保留了基質中細胞與細胞間連接、細胞表面蛋白等，細胞生物學行為和功能得以維持[4]。在本實驗中，筆者探討體外構建骨髓間充質細胞膜片的培養方法并予以改進，試圖進一步縮短膜片培養時間，同時增加膜片厚度，以利于構建組織工程骨。

1材料

1.1 實驗動物：3月齡成年新西蘭大白兔，體重2.5～3.0kg，由烏魯木齊總醫院實驗動物中心提供。

1.2 實驗儀器設備：倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympas，日本）；酶聯免疫檢測儀（BIO-RAD680， 美國）；JEM-2000EX透射電鏡 （JEOM Ltd，日本）；S-3400N 掃描電鏡 （Hitachi，日本）；X-射線能譜分析儀（Oxford，Link ISIS，英國）。

2方法

2.1 兔骨髓間充質干細胞膜片體外構建：按以往所報道的實驗方法分離培養MSCs[5]。將第2代MSCs，按密度1×106/cm2接種到直徑10cm的培養皿，使用含成骨誘導劑的DMEM/F12培養液（含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸鈉10mM、抗壞血酸 50mg/L）， 置于37℃，5%CO2培養箱孵育，隔日換培養液1次。連續培養直至皿底形成半透明乳白色薄膜樣物。

2.2 組織學檢查：4%多聚甲醛固定膜片，分別行HE和茜素紅組織學染色。光鏡下觀察膜片顯微結構。

2.3 超微結構觀察：同時選取部分膜片，以3% 戊二醛固定，分別行透射電鏡觀察及掃描電鏡觀察標本表面的微細形貌。并選擇礦化結節中心點檢測，通過X-射線能譜分析儀了解礦化結節表面的元素組成。

2.4 堿性磷酸酶活性定量測定：細胞膜片加入裂解液（0.2% TritonX-100），充分裂解后離心，取上清與磷酸硝基苯基磷酸鹽37℃反應30 min，酶聯檢測儀（405 nm波長）測光吸收值，行ALP活性定量檢測。

3結果

3.1 膜片大體觀察：MSCs高密度接種后體外培養5天左右，形成薄膜樣物質，并逐漸增厚，12～14天，所獲膜片具備一定的彈性和較好的機械性能，呈現半透明乳白色（如圖1）。小心用細胞刮刀沿培養皿底刮擦，將膜狀物與皿底分離，可用眼科鑷將其完整夾持起來，進行卷曲或折疊等操作。

3.2顯微結構觀察：MSCs增殖旺盛，3天后呈復層生長，逐漸由梭形變為胞體較小的立方形，并出現多角形成骨樣細胞，胞質顏色變深。繼續誘導后，胞外基質分泌逐漸增多，鈣鹽不斷沉積，14天左右形成不透光礦化結節，見圖2。

3.3 組織學觀察：HE染色顯示，膜片是由12～15層細胞及細胞外基質組成的聚集體（圖3A）。茜素紅染色見細胞外基質中沉積有多個大小不等的鈣化結節（圖3B），表明膜片具有成骨能力。

3.4 超微結構觀察：TEM觀察膜片兩面均有細胞，排列成多層結構。高倍鏡下可見粗面內質網及膠原纖維豐富（圖4），說明合成和分泌蛋白質功能旺盛。細胞外基質內大量針狀鈣鹽結晶沉積，部分為局灶性的。SEM見成骨誘導分化的膜片中細胞被自己所分泌的細胞外基質包埋，基質中見大量礦化結節聚集（圖5）。礦化結節X射線能譜分析結果顯示有鈣、磷、碳、氧、鈉、鎂六種元素構成，鈣、磷兩種元素的重量構成分別為（10.09 ± 0.01）% 和（4.53 ± 0.01）%，比值為2.23（圖6A）。

3.5 堿性磷酸酶活性定量檢測：結果表明，膜片成骨誘導分化后ALP活性隨著時間延長而穩步增加，至第14天ALP值達到峰值， 見圖6B。

4討論

目前利用細胞膜片技術，已成功構建出角膜、皮膚、肝臟、心肌、血管等多種軟組織[6]。細胞膜片技術的優點在于：①種子細胞利用效率高，體外擴增的細胞幾乎可全部被用于組織構建；②細胞與細胞外基質復合體可直接用于組織構建，通過疊層實現三維構建，可避免使用外源性支架材料伴隨的一些反應，更具有良好的生物相容性；③保留了細胞-細胞間、細胞-基質間連接和細胞表面蛋白等。

近期國內也有將骨髓間充質干細胞細胞膜片應用于骨組織工程的研究報道[7-8]，但該技術需要特殊的溫度敏感性培養皿和提取設備，通過溫度變化，20min左右細胞與細胞外基質一起脫落形成完整的細胞片層。馬東洋[9]等實驗所構建的骨髓間充質干細胞膜片，采用DMEM培養基，膜片厚度僅100 μm 左右。Sonja[10]研究發現，選擇恰當的培養基對于細胞生長和增殖非常重要，并證實了選用DMEM/F12培養基，MSCs增殖率最高。本實驗，改進了以往細胞膜片的體外構建方法，選擇DMEM/F12培養基促進MSCs增殖，同時利用抗壞血酸促進MSCs擴增和分泌大量胞外基質，縮短了以往的培養時間， 4～5天即可形成薄層膜片，經過12～14天左右的連續誘導培養，HE染色顯示膜片的多層結構厚度增加到200μm以上，膜片相應的彈性和機械性能也隨之增加，更便于操作。用兩把鑷子就可將細胞膜片完整提起來，僅僅需要幾秒鐘，不必借助特殊的材料或設備，簡捷的可操作性，更利于膜片的進一步塑形和三維構建。

實驗證實，經上述條件培養液孵育的細胞膜片具有成骨分化的潛能。經定量分析膜片中的細胞具有較高的ALP活性。此外，茜素紅染色表明膜片基質中有大量大小不等的鈣化結節形成，證實了MSCs向成骨細胞分化后期的表型特征。同時掃描電鏡、透射電鏡下都觀察到礦化的細胞外基質。尤其是，對膜片中的礦化結節進行X射線能譜分析結果顯示有鈣、磷、碳、氧、鈉、鎂六種元素構成，鈣、磷兩種元素的重量構成分別為（10.09±0.01）% 和（4.53±0.01）%，比值為2.23，接近于天然骨。細胞膜片工程研究將為骨組織再生重建開辟廣闊的前景。

[參考文獻]

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[收稿日期]2012-06-11 [修回日期]2012-08-17

編輯/張惠娟