銀杏達莫注射液對實驗性2型糖尿病大鼠腎臟轉化生長因子－β1表達的影響

任鳳云 宋秋穎 張增雷 劉 星 (牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157110)

轉化生長因子(TGF)-β1表達增高與2型糖尿病腎病(2-DN)密切相關，因此，通過阻斷和下調TGF-β1表達可能有助于延緩2-DN的進展。本實驗探討銀杏達莫注射液對2-DN的緩沖作用和對腎臟TGF-β1表達的影響，探討其對2-DN大鼠腎臟的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 銀杏達莫注射液夠于貴州益佰制藥股份有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司產品;TGF-β1免疫組化試劑盒購于美國R＆D公司。

1.2 實驗方法 隨機選取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重180～200 g，適應性喂養7 d。隨機取15只作為正常組(A組)，另外45只為模型組(B組)給以高脂飲食，持續喂養8 w后，腹腔一次性注射STZ注射劑15 mg/kg，隨機宰殺大鼠，檢測腎組織病理及各項指標。A組15只給以基礎飼料喂養，8 w后注射相同體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。B組大鼠注射STZ 12 w之后，大鼠出現典型的2-DN特點。將造膜成功的DN大鼠隨機選取30只分成B組和C組各15只，治療組以0.5 ml/kg銀杏達莫注射液腹腔注射對大鼠進行治療，B組繼續給予高脂飲食，8 w 后處死大鼠〔1〕。

1.3 普通標本 注意大鼠一般情況及行為改變。定時稱重并留取血尿標本。

1.4 腎組織病理標本 乙醚麻醉，斷頭處死大鼠，取腹正中切口，暴露并切取雙腎，左腎用甲醛固定，石蠟包埋組織切片;右腎迅速置于液氮中封存。

1.5 實驗室檢查 造模前、造模成功和實驗結束前分別測各組動物空腹血糖(FPG)、葡萄糖耐量(OGTT)、Scr、BUN、Upr等指標。腎組織行HE染色，光鏡下觀察腎小球形態結構及間質改變。Real time RT-PCR法檢測 TGF-β1 mRNA表達。ELISA法檢測血清中TGF-β1分泌水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0完成，計量資料以s表示，組間比較用方差分析(t檢驗)，兩兩比較采用LSD檢驗，兩組間的關系比較采用直線相關分析。

2 結果

2.1 一般狀況改變 成模大鼠體毛雜亂且反應遲緩，明顯的多尿、多食、體重減輕。

2.2 實驗大鼠OGTT變化 B組大鼠糖耐量出現明顯異常，與A組比較有顯著差異(P＜0.01)，1 h血糖達最高，2 h血糖仍高;A組大鼠30 min血糖達到最高，2 h基本恢復正常。見表1。

2.3 銀杏達莫注射液對2-DN大鼠BUN、Scr、24 h尿蛋白影響與A組相比，B組及C組大鼠BUN、SCr、24 h UPr顯著升高(P＜0.01);與 B組相比，C 組 BUN、Scr、24 hUPr顯著降低(P＜0.01)。見表2。

2.4 HE染色顯微鏡觀察腎組織結構 A組:腎小球、腎小管結構正常，腎小管排列整齊，腎小球、腎小管及間質未見病理改變。B組:腎小球系膜細胞增生，腎小球細胞數量減少，毛細血管腔塌陷，部分腎小球萎縮，腎小管上皮灶性細胞腫脹、自溶、壞死。C組:多數腎小球、腎小管結構基本正常。部分腎小球系膜基質增生，周圍腎小管輕度擴張，腎小管上皮細胞輕度腫脹、自溶，但無明顯壞死。見圖1。

2.5 銀杏達莫注射液對2-DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達的影響 B組的TGF-β1 mRNA表達量最高(1.54±0.492)，A組為0.55±1.21;經銀杏達莫注射液治療后TGF-β1 mRNA表達量明顯下降(0.92±0.082，P＜0.05)。

2.6 銀杏達莫注射液對血清中TGF-β1分泌的影響 TGF-β1含量明顯高于A組〔(3 272.41±268.38)pg/ml vs(764.90±204.33)pg/ml，P ＜0.01〕，C 組 TGF-β1 含量較 B 組明顯降低〔(1 728.94 ±384.68)pg/ml，P ＜0.05〕。

表1 正常大鼠與模型大鼠糖耐量的變化(s)

表1 正常大鼠與模型大鼠糖耐量的變化(s)

與A組比較:1)P＜0.01

別 n0 h 0.5 h 1 h 2 h組B組 40 15.51±2.05 19.58±2.09 25.17±3.101)20.55±2.561)A組15 5.34±1.43 10.42±1.45 7.53±1.24 5.82±0.90

表2 銀杏達莫注射液對大鼠BUN、Scr、UPr的影響( s，n=15)

表2 銀杏達莫注射液對大鼠BUN、Scr、UPr的影響( s，n=15)

與A組比較:1)P＜0.05;與B組比較:2)P＜0.05

組別 BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)UPr(mg/24 h)A組6.49±0.64 53.30±3.55 9.16±1.34 B組 21.88±3.111) 120.27±5.881) 26.88±4.771)C組 13.44±2.491)2) 79.32±3.121)2) 18.20±1.951)2)

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學改變

3 討論

在DM發生前胰島素抵抗往往已經存在。本模型采用健康大鼠高熱量飲食一段時間，使之產生胰島素抵抗。因機體胰島代償能力強，單純嚴重的胰島素抵抗不足以引起DM。小劑量STZ破壞胰島程度輕，單純作用不影響基礎胰島素的分泌，它與高熱量飲食兩者獨立干預均不能造成DM，只有兩者結合可能使大鼠發生高血糖。大鼠對STZ的敏感性具有年齡依賴性，成鼠及大體重鼠較幼鼠或小體重鼠更易成模。STZ的劑量決定了同一種系中STZ致β細胞損傷嚴重程度，小劑量STZ誘導鼠類β細胞系INS 1凋亡，高劑量則導致壞死。STZ劑量越小對對其他組織造成的損害越小。

TGF-β1是導致腎間質纖維化和腎小球硬化的重要作用因子之一〔2，3〕。作為一種重要的致纖維化因子，TGF-β1參與 ECM成分的進行性積聚過程，如刺激ECM中纖維連接蛋白、膠原等合成，減少蛋白酶表達和增加蛋白酶抑制合成，上調ECM受體整合素的表達，促進細胞與間質黏附和基質沉積等〔4，5〕，抗TGF-β1治療能夠善DN大鼠腎臟的損傷情況，減少ECM的聚集〔6〕。本實驗表明，TGF-β1基因表達水平與DN間質損害程度密切相關。2-DN大鼠早期腎臟TGF-β1基因的表達顯著增加，尿TGF-β1表達水平與尿白蛋白及尿肌酐顯著相關，而與體重及血糖改變無相關性。實驗性大鼠TGF-β1蛋白表達增加可能參與2-DN的早期發病機制，腎小球濾過功能增加，尿蛋白排泄增加，TGF-β1基因表達水平高低一定程度上反映腎小球硬化和間質損害的嚴重程度。

2-DN最初表現為蛋白尿，繼而出現腎功能下降，血肌酐和尿素氮升高，2-DN的主要臨床表現為有水腫、高血壓以至低蛋白血癥，其輕重主要與腎臟損害程度有關。DN中，肉眼所見受累腎臟不論是病變早期還是病變晚期，其體積均傾向增大。在組織學改變中，腎小球病變大體反映了DN的特征，其最初受累部位在系膜，基本病變是基底膜物質增多，并侵占系膜細胞，同時伴有毛細血管基底膜增厚。本實驗證實銀杏達莫注射液可以有效地保護和治療2-DN腎臟的損傷。

1 任鳳云，郭麗雙，馮 華，等.銀杏達莫注射液對實驗性2型糖尿病大鼠腎臟TGF-1表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(22):4604-6.

2 Wu Y，Ren K，Liang C，et al.Renoprotective effect of total glucosides of paeony(TGP)and its mechanism in experimental diabetes〔J〕.J Pharmacol Sci，2009;109(1):78-87.

3 孫培榮，石永兵，施曉松.銀杏達莫對梗阻性腎病大鼠腎間質纖維化中TGF-β1表達的影響［J］.中國誤診學雜志，2010;26(9):6304-6.

4 Dixon A，Maric C.17β-estradiol attenuates diabetic kidney disease by regulating extracellular matrix and transforming growth factor-βprotein expression and signaling〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2007;293(5):1678-90.

5 Van Huyen JP，Viltard M，Nehiri T，et al.Expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 is altered during nephrogenesis in fetuses from diabetic rats〔J〕.Lab Invest，2007;87(7):680-9.

6 Wang W，Huang XR，Canlas E，et al.Essential role of Smad3 in angiotensin Ⅱ-induced vascular fibrosis〔J〕.Circ Res，2009;98(8):1032-9.