產表面活性劑菌的篩選和驗證實驗研究

張夙夙

摘要 [目的]探究廢棄鉆井液中產表面活性劑菌株的性能。[方法]以廢棄的鉆井液為原材料，利用生物表面活性劑的性質進行產表面活性劑菌株的培養和篩選，并且將篩選出來的產表面活性劑菌進行排油活性和乳化性能的測定。[結果]篩選出的產表面活性劑菌排油圈的直徑約為4 cm，乳化層初始較厚，1 d后變薄。[結論]篩選出的產表面活性劑菌排油活性較好，但乳化性能不穩定。

關鍵詞 產表面活性劑菌；培養；篩選；驗證

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-04967-02

隨著我國經濟建設的發展，石油開采規模日益擴展，但是由于技術的落后與環保意識的缺乏， 土壤石油污染越演越烈，并且嚴重威脅到人們的生存環境和身體健康。油田中鉆井、洗井、采油、運輸、煉制等過程中會有數量不等的原油被排放到環境中，使得土壤受到不同程度的污染[1]。石油在土壤中的積累將導致土壤結構的破壞，影響土壤孔隙率，并且對農作物的生長和發育造成很大的負面影響[2]。同時，石油烴通過“土壤—植物—人”這一食物鏈進入人體內，危害人體健康[3]。所以，探究土壤石油污染的治理方法顯得極為迫切。

各種修復技術各有所長也各有所短，其中微生物修復技術因其具有速度快、消耗少、效率高、成本低、反應條件溫和以及無二次污染等優越性而被人們所提倡。微生物修復的一個關鍵技術就是生物表面活性劑的應用。生物表面活性劑能顯著降低表面張力，提高不溶性石油組分的生物可利用性。與化學表面活性劑相比，生物表面活性劑具有特異性強、高效、低毒、不污染環境以及生產成本低等優點。因此，生物表面活性劑已被廣泛地應用于石油污染土壤的修復實踐中，顯示出良好的應用前景。筆者以廢棄的鉆井液為原材料，利用生物表面活性劑的性質進行產表面活性劑菌株的培養和篩選，并且將篩選出來的產表面活性劑菌進行排油活性和乳化性能的測定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 生物菌劑。以廢棄的鉆井液為菌源，以原油為唯一碳源進行菌株培養。

1.1.2 培養基。

1.1.2.1 細菌富集培養基。將KH2PO4 1.0 g、K2HPO4 1.0 g、NH4NO3 1.0 g、CaCl2 0.02 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 10 g溶于1 L去離子水中，用 NaOH 調 pH 至 7.0。

1.1.2.2 血平板培養基。將牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g、酵母粉0.01 g、NaCl 0.5 g、瓊脂粉2.0 g溶于100 ml 去離子水中。滅菌后將培養基冷卻到50 ℃，然后按 8% （V/V）用量把綿羊血無菌操作加到冷卻的培養基中，輕輕搖勻后倒平板即可。注意不要產生氣泡。

1.1.2.3 藍色平板培養基。將牛肉膏 0.3 g、蛋白胨 1.0 g、酵母粉 0.01 g、NaCl 0.5 g、瓊脂粉2.0 g十六烷基三甲基溴化銨0.5 g、亞甲基藍0.002 g溶于100 ml去離子水中，用 NaOH調pH至7.0，高壓下蒸氣滅菌20 min。待冷卻后，輕輕搖勻后倒平板即可。

1.1.2.4 LB培養基。胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，用NaOH調節pH達7.4，高壓下蒸氣滅菌20 min。

1.1.2.5 復篩搖瓶培養基。將牛肉膏7 g、葡萄糖5 g、NaNO3 2.5 g、KH2PO4 4 g、K2HPO4 4 g、 CaCl2 0.1 g、MgSO4 0.2 g、 NaCl 1 g、 KCl 1 g溶于1 L去離子水中，用NaOH調pH至7.5，高壓下蒸氣滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣。采集廢棄的鉆井液作為試驗樣品。

1.2.2 富集培養。稱取10 g原油樣品，用無菌水稀釋100 ml，靜置15 min。濾去沉淀，取濾液5 ml，加入裝有95 ml富集培養基的250 ml錐形瓶中，加塞，32 ℃搖床培養2 d。

1.2.3 初步篩選。將富集培養的菌液梯度稀釋至10～5，采用涂布法分別接種到血平板培養基和藍色平板培養基上，放置在30 ℃培養箱中，培養2 d，觀察菌落。在血平板培養基上，菌落周圍會形成溶血圈；在藍色平板培養基上，菌落周圍會有藍色的暈圈。

1.2.4 挑取再培養。用接種環挑取能夠產生溶血圈的菌和周圍有藍色暈圈的菌，采用劃線法分別接種到血平板培養基和藍色平板培養基上進行培養。

1.2.5 LB培養基培養。挑選能產生溶血圈的和能產生藍色暈圈的單菌落，接種到LB培養基，37 ℃條件下搖床培養24 h，做好標記，編號。

1.2.6 復篩搖瓶培養。用移液槍從LB培養基中抽取5 ml菌液至一滅菌的盛100 ml發酵培養基的250 ml三角錐形瓶中，32 ℃搖床培養3 d。

1.2.7 生物表面活性劑排油活性的測定。取一定量的發酵培養液，1 000 r/min離心10 min，得上清液，取直徑為20 cm的培養皿，加入90 ml蒸餾水，并且加入0.5 g蘇丹III染色，然后加入1滴柴油，待柴油均勻分布于水面上后，在柴油膜的中央慢慢加入80 μl上清液，觀察排油圈大小。

1.2.8 生物表面活性劑乳化性能的測定。取一定量的發酵培養液，1 000 r/min離心10 min，得上清液，取3 ml上清液與等體積的柴油，加到乳化管中，攪拌，混合均勻，制備懸濁液，觀察乳化相和油相的體積變化以及乳化性能的穩定性。

2 結果與分析

2.1 產表面活性劑排油性檢測 試驗結果見圖1。經測量，玻璃平皿的直徑為20 cm，排油圈的直徑約為4 cm。

2.2 產表面活性劑乳化性能的檢驗

2.2.1 初始相。由圖2可知，乳化層較厚。

2.2.2 變化相。由圖3可知，形成乳化層1 d后，乳化層變薄，說明該產表面活性劑菌的乳化性能不穩定。

3 討論

以廢棄的鉆井液為原材料，利用生物表面活性劑的性質

圖2 產表面活性劑乳化性能的檢測（初始相）

圖3 產表面活性劑乳化性能的檢驗（變化相）進行產表面活性劑菌株的培養和篩選，并且將篩選出來的產表面活性劑菌進行排油活性和乳化性能的測定。經測定，該試驗篩選出來的產表面活性劑菌排油活性較好，但乳化性能不穩定。

參考文獻

[1] 葉建陽，葉向德，郭軍權.石油工程環境保護[M].楊凌：西北農林科技大學出版社，2010.

[2] 呂志萍，程龍飛.石油污染土壤中石油含量對玉米的影響[J].油氣田環境保護，2001，11（1）：36-37.

[3] 馬志華.石油對海洋環境造成的污染究竟有多大[J].森林與人類，2002（12）：8-9.