膽汁納米細菌的培養與鑒定研究

林榮華

【摘要】目的 探討膽汁中膽汁納米細菌的培養與鑒定。方法 對40例膽結石患者膽汁標本進行了納米細菌培養，觀察生長情況。結果40例膽結石患者膽汁標本納米細菌培養為陽性。掃描電鏡能譜分析顯示，納米細菌外殼含有鈣、磷和鎂等元素，其鈣/磷比值為1.60。結論 膽囊結石患者膽汁中存在納米細菌感染。鈣染色對納米細菌的鑒定有重要參考價值。

【關鍵詞】膽汁；納米；細菌；培養；鑒定

【中圖分類號】R-1 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2014）10-0294-02

納米細菌是在胎牛的血清中發現的一種直徑在80-500nm的特殊生物微粒。納米細菌廣泛存在于生物體和礦物質中，是一種會感染人和動物的致病原。相關的學者已經在國內部分人的血清中發現了納米細菌，并且發現其的感染與年齡有關系。

1對象與方法

1.1 對象

選取了本醫院中手術前無急性膽囊炎發作病史，本次住院未進行抗菌治療，并且擬結束腹腔鏡膽囊切除的膽囊結石患者40例，男的24例，女16例，年齡在38-65歲之間。

手術前將患者的膽汁標本統一留取。術中由腹腔中完整取出膽囊后，立即用無菌注射器穿刺膽囊，無菌操作抽取膽汁5ml。

1.2主要試劑

高糖DMEM培養基，GIBCO公司，美國； 射線照射過的胎牛血清（ -FBS），中美合資蘭州民海生物工程有限公司，中國；鼠抗納米細菌單克隆抗體，Nanobac OY公司，芬蘭；FTTC 標記熒光抗體，Dako Cytomation公司，丹麥。

1.3方法

1.3.1 納米細菌培養

將膽汁樣本通過一次性輸液器濾膜過濾2次后，依次經0.45 m和0.22 m一次性正壓濾器過濾，將濾液0.1ml注入含DMEM培養液、10% -FBS和1%HEPES緩沖液的細胞培養瓶中， 37℃、5%CO2條件下培養。以生理鹽水替代膽汁重復上述操作作為陰性對照。每周于倒置顯微鏡下觀察其生長情況并記錄。

1.3.2納米細菌的鑒定

間接免疫熒光染色：取含納米細菌的培養液16000rpm離心45分鐘，PBS洗滌沉淀，棄上清，加入無水乙醇職稱懸液，將該懸液滴置潔凈載玻片上自然晾干后置入95%乙醇和乙醚混合液（1：1）中固定15分鐘，制成納米細菌滴片，之后首先用含10%FBS（經培養證實不含納米細菌）的PBS封閉20分鐘，一抗（100mg/l）室溫孵育60分鐘，PBS洗滌5分鐘持續4次，二抗室溫孵育45分鐘，PBS洗滌5分鐘持續4次，雙蒸水洗滌1分鐘，50%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察，以PBS代替8D10抗體作陰性對照。

納米細菌鈣染色：制納米細菌滴片方法同上，滴加1%硝酸銀溶液覆蓋滴片，紫外線照射45分鐘。蒸餾水充分沖洗，滴加3%硫代硫酸鈉溶液覆蓋滴片，反應5分鐘.蒸餾水充分沖洗后于普通光學顯微鏡觀察染色結果。

透射電鏡觀察：吸取含納米細菌的培養液，16000rpm離心45分鐘，用PBS洗滌沉淀，2.5%戊二醛4℃固定24小時，雙蒸水洗滌5分鐘，持續三次，離心后加入0.5ml雙蒸水制成混懸液。進行負染色時，將附有碳支持膜的200目銅網浮于上述懸液的液滴上5分鐘，用濾紙小心吸除液體，置于10ml/L磷鎢酸懸液的液滴上90秒，用濾紙小心吸除液體、晾干，在H-7650透射電鏡下觀察，工作電壓80kV。

納米細菌超薄切片觀察：吸取含納米細菌的培養液同上，戊二醛4℃固定4小時，PBS沖洗，15分鐘，持續2次。1%四氧化鋨4℃固定2小時。50%、70%、90%丙酮脫水，每梯度15分鐘。100%丙酮脫水2次，每次15分鐘。丙酮和環氧樹脂一樣的數量浸透2小時，純環氧樹脂浸透2h。37℃-40℃條件下入膠囊浸透6-12h，60℃聚合24小時。用鉆石刀將納米細菌樣本切成超薄切片，5%醋酸鈾染色5分鐘，雙蒸水洗3分鐘 3次，構椽酸鉛染色5分鐘，雙蒸水充分洗滌后干燥。在H-7650透射電鏡下觀察。

納米細菌能譜分析：吸取含納米細菌的培養液同上，用2.5%戊二醛4℃固定4小時，雙蒸水洗滌，加入0.5ml無水乙醇制成混懸液。在配有VANTAGE BSI型能譜儀的國產KYKY2800型掃描電鏡上，對其進行能譜分析，工作電壓200KV。

2 結果

2.1 膽汁納米細菌培養

40份膽汁標本納米細菌培養都是陽性。在37℃和5%CO2的細菌培養條件下培養14天，于倒置相差顯微鏡下可觀察到做不規則布朗運動的細微顆粒狀物。這些細微顆粒的體積會隨著時間的推移慢慢變大，不斷增多數量，積聚成團，并逐漸貼附于培養瓶底部，形成細菌集落。在第四周時，會看到更多的白色細菌顆粒集貼附在培養瓶底部。鏡下觀察陰性對照培養液，未見納米細菌生長。

2.2 膽汁納米細菌的堅定

間接免疫熒光染色。納米細菌與8DI0抗體產生特異性結合。陰性對照為觀察到綠色熒光。

普通光鏡下觀察，納米細菌的礦化外殼被硝酸銀染成黑色，視野中布滿了黑色小顆粒。

納米細菌經負染后于透射電鏡下觀察，其外形呈球形或短棒狀顆粒，大小約為80～350mm。超薄透片透射電鏡觀察，納米細菌中心電子密度較低，而周圍被厚厚的呈黑色電子密度較高的礦化外殼包繞。納米細菌在37℃恒溫、潮濕、5%CO2環境中，可以進行緩慢的分裂增殖。新生成的納米細菌為50～200nm。

納米細菌能譜分析顯示，納米細菌含有鈣，磷，鎂，鋁等元素，其鈣磷比值是1.62。

3 討論

納米細菌不能用傳統的微生物理論看，因為體形微小，很難用一般的細菌學檢測方法檢出，而且侵入生物體內的納米細菌具有獨特的生物礦化作用，很難被徹底清除，所以，納米細菌一直是醫學界的熱點問題。

我們對選取的40位患者，在無菌、厭氧條件下留取膽囊結石患者的膽囊膽汁，進行納米細菌培養。

正常膽汁中存在大量的黏蛋白以及膽砂、膽固醇結晶等多種有形成分，這些成分給膽汁中分離納米細菌造成麻煩。所以，應該探尋從復雜的膽汁中迅速提取納米細菌的方法。

本研究顯示，在膽囊結石患者的膽汁中確實存在納米細菌，由人膽汁中培養出的納米細菌極其微小，在普通光學顯微鏡下幾乎無法觀測，但在相差顯微鏡下卻可以比較容易的觀測到，而對其細微結構的觀察則只能通過分辨率更高的電子顯微鏡才能實現。

參考文獻：

[1]Hjelle JT ，Marcia A Miller-Hjelle MA.Endotoxin and nanobacteria in polycustic disease[J].Kidney Int，2000，57：2360.

[2]Kajander EO.Nanobacteria-propagating calcifying nanoparticles[J].Letters in Applier Microbiology，2006，42：549.