2株分離自黃龍冷水型水體中土著細菌的胞外有機酸代謝組分分析

李騏　李瓊芳　王建萍　馬政慶　包莉萍　喬銳　鄧雄

摘要：對2株分離自黃龍冷水型水體的土著細菌020-18、021-3生長各階段的胞外有機酸代謝組分進行了表征分析。結果表明：在遲緩期、對數期、穩定期及衰亡期等各個生長階段，2菌株向胞外分泌7種有機酸的成分及含量各異；在對數期、穩定期生長階段，2菌株在胞外積累了蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸。

關鍵詞：高效液相色譜；細菌；有機酸；黃龍風景區

中圖分類號： Q657.7+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0274-04

收稿日期：2013-08-27

基金項目：國家自然科學基金主任基金（編號：41040004）。

作者簡介：李騏言（1988—），女，福建龍巖人，碩士研究生，從事微生物研究。E-mail：leeqiyan@163.com。

通信作者：李瓊芳，博士，副教授，主要從事微生物研究。E-mail：liqiongfang1992@126.com。黃龍風景區位于四川省阿壩藏族羌族自治州松潘縣內，海拔3 145～3 578 m ，溝內鈣華沉積長3.6 km，寬110～250 m，厚9～20 m，其獨特的鈣華沉積景觀色彩絢麗，于1992年被聯合國教科文組織列為世界自然遺產，是我國最為珍貴的自然景觀之一。鈣華景觀的形成主要是CaCO3—H2O—CO2三相相互作用的結果[1]。目前國內眾多學者對于鈣、水的來源已經基本達成了共識[2]，但對于CO2的來源主要存在2種觀點，即冷成因論[3]（或氣候成因論）與熱成因論[4]（深成因論）。冷成因論認為，CO2主要來源于土壤及大氣，認為生物成因、大氣成因占主導作用；熱成因論認為，CO2主要來自地球內部。鈣化景區冷水型水體中土著微生物通過自身呼吸作用產生并釋放的CO2作為灰巖的侵蝕溶解動力是很有可能的，但更為重要的是微生物能通過自身代謝產物（如有機酸、氨基酸、多糖、蛋白質等）對碳酸鹽巖的沉積產生巨大影響。有學者認為，微生物碳酸鹽巖沉積作用的發生主要是建立在胞外聚合物（EPS）、微生物膜（biofilm）、微生物席（microbial mat）等生物基礎之上的[5-6]。微生物通過向胞外分泌EPS，不斷捕捉及黏附鈣離子，將微小晶粒附著于微生物膜（亞毫米級）上。微生物膜在捕捉、黏附的同時也可通過自身不斷生長成更厚的微生物席（毫米級），進而對較大的沉積顆粒進行捕捉、黏附，最終形成微生物碳酸鹽巖。近年來，國內外眾多學者對微生物介導的碳酸鹽巖沉積物進行了大量研究，肯定了碳酸鹽巖沉積形成過程中微生物所起的重要作用。邢智峰等發現，在西云夢山組地層的縱剖面上，毫米級的深色沉積物層、淺色石英顆粒層交替出現，形成了典型的微生物席紋層，表明微生物在沉積表面發生多次生長、埋藏[7]。唐鑫萍等認為，山東省平邑盆地古近系湖相的3種微生物碳酸鹽巖（核形石、疊層石、凝塊石）是以微生物成因組構（EPS、微生物膜、微生物席）、微生物作用為共同基礎在不同的環境條件下形成的[8]。Kenward等證實了白云石沉淀發生在異化型鐵還原菌停止活動而產甲烷古菌新陳代謝活動繁盛后，證明產甲烷菌能夠促進白云石在低溫下沉淀[9]。Tong等研究發現，左旋天冬氨酸單體的添加對碳酸球文石晶型的形成具有特殊的調節作用[10]。周雪瑩等發現，膠質芽孢桿菌在不同的培養條件下由于數量、莢膜多糖、碳酸酐酶活性的差異使得碳酸鈣晶體的數量、形貌差異較大[11]。由此可見，微生物及其豐富的胞外代謝產物對碳酸鈣晶體中晶型及形貌的影響不可忽視。本研究以探究黃龍風景區土著微生物胞外有機酸在鈣華景觀形貌形成中的參與程度為出發點，對黃龍風景區特殊冷水型水體中土著細菌在各個生長階段所分泌的胞外有機酸組分進行了分析，旨在為揭示黃龍風景區鈣華景觀形成的生物成因提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株從黃龍冷水型水體中分離篩選出2株具有較大莢膜的細菌菌株（編號：020-18、021-3）。

1.1.2有機酸標準溶液精確稱取草酸0.05 g，乳酸、冰乙酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸各0.5 g。用超純水溶解并定容至100 mL容量瓶，得到混合標準酸儲備液，密封并于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2方法

1.2.1生長曲線的繪制挑取2環菌體于盛有100 mL牛肉膏蛋白胨培養基的三角瓶中（250 mL），于150 r/min、30 ℃恒溫培養箱中振蕩培養36 h進行活化。按2.5%（V/V）接種量分別將菌體接種于盛有牛肉膏蛋白胨培養基的三角瓶中，以無菌培養基作為空白對照，每6 h取樣測定菌液D600 nm值，重復3次，繪制菌株的生長曲線。

1.2.2培養液的預處理按2.5%（V/V）接種量分別將菌體接種于盛有牛肉膏蛋白胨培養基的三角瓶中，振蕩培養條件同上。定時對不同生長時段（遲緩期、對數期、穩定期、衰亡期）的培養液進行取樣，并于10 000 r/min、4 ℃下低溫冷凍離心10 min，收集上清液，用0.45 μm微孔過濾待用。

1.2.3標準曲線的繪制取混合酸儲備液依次稀釋2、10、20、100倍，得到乙酸濃度分別為5 000、2 500、500、250、50 mg/L 的標準混酸溶液，密封并于4 ℃冰箱保存待用。

1.2.4色譜條件美國Agilent 1260高效液相色譜儀，ZORBA SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測波長為 205 nm；流動相為pH值為2.45的3% CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4（V/V）緩沖溶液，流速為1.0 mL/min。

2結果與分析

2.1菌株莢膜染色

菌株020-18、021-3莢膜染色后于油鏡下觀測結果見圖1，可見2菌株菌體細胞周圍包裹了1層莢膜。endprint

2.2生長曲線

由圖2、圖3可見，菌株020-18遲緩期并不明顯，6 h便已經進入對數期，20 h進入穩定期。菌株021-3具有明顯的遲緩期（0～10 h），12 h進入對數期，20 h左右進入穩定期。由于本試驗以吸光度為表征依據，衰亡期雖多數菌體已死亡，但懸濁度仍然維持一定水平，故吸光度變化不大。最終確定菌株020-18生長各時段培養時限分別為：遲緩期6 h、對數期18 h、穩定期30 h、衰亡期72 h；菌株21-3生長各時段培養時限分別為：遲緩期12 h對數期18 h、穩定期24 h、衰亡期54 h。

2.3液相色譜條件的確定

2.3.1測定波長及緩沖溶液的選取將標準混酸溶液進樣后進行全波長掃描，發現205、210、215 nm處波長對7種有機酸吸收均較好，選取分離效果最好的205 nm作為檢測波長。高效液相色譜測定有機酸試驗多用磷酸鹽或甲醇/乙腈-磷酸鹽緩沖液體系進行洗脫分離。磷酸鹽體系下各有機酸分離洗脫時間較長，但添加甲醇、乙腈后，不僅可以縮短各酸保留時間，還可以調整改善各有機酸峰型，減少拖尾。預試驗發現：3% CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4（V/V）緩沖體系在pH值為2.45條件下能較好地對各有機酸進行分離。

2.3.2柱溫、流速有機酸在緩沖液中的解離程度隨著溫度的升高而增加，不利于有機酸的分離，較高的溫度也會使有機酸分離效果變差[12]，因此本試驗選擇30 ℃作為分離柱溫，最終選擇流速為1 mL/min。

2.4有機酸標準圖譜

在已確定的色譜條件下對7種混酸溶液進行分離，色譜分離圖譜見圖4。

有機酸標準色譜圖上共出現8峰，可知從混合酸標準溶液中共分離了8種物質，除已知的7種有機酸外，必然存在1峰為雜質峰。分別配置濃度均為5 mg/L的7種有機酸的單一標準溶液，依次進樣分析，發現第7峰為雜質峰。

2.5有機酸標準曲線繪制

將稀釋倍數分別為100、20、10、2倍的標準混酸溶液依次進樣，計算不同濃度下各有機酸的峰面積，并進行線性回歸。由表1可知，各有機酸含量線性方程回歸良好。

表1各有機酸線性相關分析

有機酸1濃度范圍

（mg/L）1線性回歸方程1決定系數草酸15～5001y=7.575 1x+11.7691r2=0.999 8酒石酸150～5 0001y=0.918 4x+41.0031r2=0.999 8蘋果酸150～5 0001y=0.516 9x+23.9851r2=0.999 9乳酸150～5 0001y=0.394 2x-0.485 51r2=1.000 0乙酸150～5 0001y=0.334 7x+0.220 31r2=1.000 0檸檬酸150～5 0001y=0.613 4x+1.080 01r2=1.000 0琥珀酸150～5 0001y=0.351 1x-0.243 51r2=1.000 0

2.6菌株各時期的有機酸的測定

在已確定的色譜條件下對菌株020-18、021-3各生長時期胞外發酵液中7種有機酸進行色譜分離，其中020-18、021-3對數期分離結果見圖5、圖6。

牛肉膏蛋白胨培養基本身含有一定量的上述各有機酸，故考察菌株各生長時期胞外有機酸代謝量時，需扣除培養基中各有機酸本底值，當有機酸代謝量為負數時，表明菌株在生長代謝過程中消耗了有機酸。

由表2可知，菌株020-18在生長初期開始消耗草酸、乙酸，且需求量隨著培養時間的延長不斷增大；酒石酸、蘋果酸在菌體生長初期有一定積累，隨著培養時間的延長不斷被消耗；隨著培養時間的延長，乳酸含量呈現先增加后下降趨勢，在對數期達到最大值59.951 mg/L；隨著培養時間的延長，檸檬酸含量呈現增加—下降—增加趨勢，在衰亡期達到最大值2 111.145 mg/L。

mg/L，衰亡期含量增加；菌體生長初期，酒石酸含量達到最大值408.375 mg/L，隨著培養時間的延長，含量呈先降低后升高趨勢；菌體對數生長期對蘋果酸的消耗較大，隨著培養時間的延長，穩定期蘋果酸含量達到最大值，隨后含量下降；隨著培養時間的增加，乳酸含量逐漸增大，54 h達到最大值2 412.68 mg/L；菌體生長初期乙酸含量達到最大值1 695.052 mg/L，進入對數期后含量陡然下降，隨著培養時間的延長，衰亡期為 -2 678.12 mg/L。菌體整個生長過程中檸檬酸、琥珀酸含量皆呈現先增加后下降趨勢，對數時期檸檬酸含量達最大值192.174 mg/L，琥珀酸在對數期、穩定期含量相對穩定。表3菌株021-3各生長時期胞外有機酸代謝量

時間

（h）1有機酸代謝量（mg/L）草酸1酒石酸1蘋果酸1乳酸1乙酸1檸檬酸1琥珀酸12143.1001408.3751213.3661-31.66711 695.0521148.5521112.08818127.0671-43.0581-459.9851971.405145.2951192.17411 416.24524114.2221-359.06611 318.03912 368.2481-2 719.3301105.77611 306.00954140.0661-359.4461-161.31612 412.6801-2 678.1201-105.819172.461

3結論與討論

三羧酸循環（TCA）普遍存在于動物、植物、微生物細胞中，不僅是機體在有氧條件下獲得能量的主要代謝途徑，其中間代謝產物更是合成某些重要有機物的必要前體物質，如α-酮戊二酸、草酰胺酸分別為谷氨酸、天冬氨酸的前體。微生物生長代謝過程中，利用培養基中的營養物質，在菌體細胞內通過TCA等途徑不斷合成多種有機酸，當積累到一定濃度時，胞內外電化學梯度、滲透壓發生改變，有機酸通過跨膜運輸等方式運輸至胞外，并滯留于培養液中。最初培養基中碳源被分解利用形成丙酮酸，通過氧化脫羧方式生成乙酰CoA，并在線粒體中與起始底物草酰乙酸依次合成檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸等有機酸。在菌體生長初期，菌株020-18不同程度地合成并分泌酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸，隨著培養時間的增加，蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等TCA循環中間產物連同其他代謝有機酸（草酸、乙酸、酒石酸）被不同程度消耗。這可能是由于菌株020-18菌體細胞較大、莢膜較厚，除了大量利用培養基中的營養物質外，通過各代謝途徑合成的有機酸隨著營養物質的消耗殆盡也被不同程度重新攝入細胞加以利用，以滿足機體生長所需。隨著培養時間的延長，檸檬酸含量陡然增高，這可能與菌株利用碳源的偏好性及后期細胞內外環境劇烈改變有關，菌株020-18可能更偏向利用琥珀酸、乙酸、酒石酸等有機酸，導致重新攝入的以及通過TCA途徑不斷合成的檸檬酸暫時積累于菌體細胞內。隨著衰亡期的到來，菌體逐漸趨向凋亡，細胞內外pH值、電化學梯度以及滲透壓等環境因素發生劇烈變化，使得檸檬酸最終被大量釋放到胞外培養液中。菌株021-3在整個生長過程中均不同程度地代謝7種有機酸，由于生長初期菌體繁殖量小，少量的檸檬酸、琥珀酸在菌體內合成并分泌到胞外。隨著對數期的到來，大量乙酰CoA、草酰乙酸被消耗利用以合成ATP來維持菌體快速繁殖，導致經由TCA生成的琥珀酸、檸檬酸含量不斷增加，隨著衰亡期的到來，培養液中琥珀酸、檸檬酸含量呈下降趨勢，這可能是由于菌體在衰亡期對檸檬酸、琥珀酸的合成減少，且二者作為菌株利用效能較高的碳源被重新攝入胞內利用所致[12]。對數期蘋果酸被大量消耗，穩定期、衰亡期蘋果酸含量變化趨勢同檸檬酸、琥珀酸相似。隨著培養時間的延長，乳酸含量不斷增加，這同徐凱等的研究結果[13]一致。酒石酸含量隨著培養時間的增加呈現先降低后增加趨勢，與檸檬酸代謝趨勢相反，這同楊文洲等的研究結果[14]類似。endprint

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