HSP90和P23蛋白量和細胞亞定位在多發(fā)性骨髓瘤患者中的臨床價值

薛軍　謝曉競　高應(yīng)東

[摘要] 目的 尋找預(yù)測MM患者GC敏感性指標。 方法 以MM患者作為研究對象，采用ELISA法檢測MM患者血清HSP90濃度，Western Blot檢測MM患者PBMNC中P23蛋白表達，探討其與GC抵抗的關(guān)系。 結(jié)果 （1）MM患者血清HSP90含量明顯比正常人高（P<0.05），且GC敏感組患者較GC抵抗組患者高（P<0.05），但各組P23血清濃度之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；（2）P23蛋白低表達患者和P23蛋白高表達患者治療有效率分別為86%和33%，二者相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在5年隨訪中，前者生存率高于后者（P<0.05）；（3）HSP90和P23蛋白在MM1.S、MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗的MM患者均位于胞漿內(nèi)，無定位意義。 結(jié)論 血清HSP90和P23蛋白表達能預(yù)測MM患者對GC的敏感性和生存情況，可用此指標指導(dǎo)臨床用藥。

[關(guān)鍵詞] 多發(fā)性骨髓瘤；糖皮質(zhì)激素；熱體克蛋白90；輔分子伴侶P23

[中圖分類號] R733.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）13-20-04

[Abstract] Objective To find the predicitive indicators of GC sensitivity in the patients with multiple myeloma （MM）. Methods The patients with MM were selected as the study subjects. The ELISA was used to detect the serum heat-shock protein 90 （HSP90） concentraion in the patients with MM and the Western Blot was used to detect the P23 protein expression in PBMNC in the patients with MM， and their relationship with GC resistance was explored. Results （1） The patients with MM had significantly higher HSP90 content than normal people （P<0.05）， and the GC sensitive group was higher than the GC resistant group （P<0.05）， but the P23 serum concentration was not different between each group （P>0.05）； （2） The effective treatment rates of the patients with low P23 protein expression and the patietns with high P23 protein expression were 86% and 33% respectively， with significant difference between the two groups （P<0.05）， and in the 5-year follow-up visit， the former had higher survival rate than the latter （P<0.05）； （3） Both HSP90 and P23 protein existed in the cytoplasm of MM1.S and MM1.R cell strains as well as the the patients with MM who were sensitive and resistant to GC， and had no locating value. Conclusion Serum HSP90 and P23 protein expression can predict the MM patients' sensitivity to GC and survival situation， thus can be used to guide clinical drug use.

[Key words] Multiple myeloma； Glucocorticoids； Heat-shock protein 90； Auxiliary chaperone P23

前期研究顯示[1]：HSP90輔分子伴侶蛋白P23在MM1.S、MM1.R、正常人和MM患者外周血單個核細胞中表達存在著明顯的差異性，在此基礎(chǔ)之上，我們進一步探討多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者血清HSP90和P23蛋白含量，以及它們在細胞內(nèi)亞定位水平在糖皮質(zhì)激素抵抗（glucocorticoid resistance）中的作用，以便找到更加簡便易行的判斷糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）敏感性的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Western Blot試劑盒購自Bio-Rad公司，鼠抗人P23、鼠抗人HSP90及鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自Santa Cruz公司。HSP90和P23蛋白ELISA法檢測試劑盒購于上海西康生物科技有限公司。酶標儀（美國BIO-RAD伯樂680型全自動酶標儀）。

1.2 臨床資料

取42例MM患者靜脈血5mL，分離血清和單個核細胞存于-80℃冰箱備用。42例MM患者來自南京醫(yī)科大學南京市第一醫(yī)院血液科，所有患者均符合MM診斷標準[2]。MM患者42例，男性18例，女性24例，年齡53～85歲（平均年齡69歲），初診21例，緩解期13例，復(fù)發(fā)8例，IgG型21例，IgA型13例，輕鏈型6例，末定型2例，選取10名年齡和男女比例相仿的健康人作對照組。化療方案包括VAD（長春新堿，阿霉素，地塞米松），萬珂+地塞米松，MP（馬法蘭，尼松），自體造血干細胞移植術(shù)。endprint

1.3 療效判斷標準

按國內(nèi)多發(fā)性骨髓瘤療效判定指標及標準[3]，達到完全緩解、部分緩解和進步者為糖皮質(zhì)激素敏感，無效者為糖皮質(zhì)激素抵抗。

1.4 Western Blot檢測蛋白表達

收集5×106個細胞，用蛋白裂解液裂解細胞后，離心去細胞碎片，取上清液，經(jīng)Bradford分析方法定量細胞總蛋白，各組取60mg總蛋白進行12% SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用1%牛血清白蛋白（BSA）和0.05% Tween20封閉非特異性抗原后，一抗4℃溫育過夜。次日TBST洗膜后，二抗羊抗小鼠IgG-HRP 1∶5000稀釋，37℃溫育1h，TBST洗膜后ECL熒光顯色。蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進行掃描，以GAPDH條帶作為參照Imagaquent5.1軟件對蛋白質(zhì)條帶灰度進行相對定量分析。以目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值表示蛋白相對表達水平（重復(fù)3次）。

1.5 ELISA法檢測MM患者血清HSP90和P23蛋白質(zhì)含量

本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。嚴格按試劑盒說明操作，簡述如下，激活：首先標本激活；加樣：酶標板各孔加入待測已激活血清100μL，混勻后置37℃40min，洗板；加一抗：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，在濾紙上印干，各孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50μL，充分混勻后置37℃20min，洗板同前；加二抗：各孔加入酶標工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)10min，洗板同前；顯色：各孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15min；終止反應(yīng)：各孔加入100μL終止液混勻，30min內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值，根據(jù)吸光值計算相應(yīng)HSP90和P23含量（靈敏度：最小的HSP90和P23檢測濃度分別小于65pg/mL和8pg/mL）。

1.6 細胞免疫熒光亞細胞定位

4%多聚甲醛固定細胞，用PBS溶液洗滌3次，1% triton室溫下通透5min，再用PBS洗滌4～5次；每張切片滴加2滴1% H2O2-甲醇溶液，室溫15～25℃封閉10min，PBS浸洗3次；滴加即用型山羊血清50～100μL，室溫孵育20min；滴加一抗（1∶200稀釋）50～100μL，37℃，濕盒孵育2h，PBS浸洗3次。PBS洗4～5次，滴加熒光二抗，避光反應(yīng)1h，PBS洗4～5次；配置DAPI復(fù)染液，室溫避光孵育5min，防萃滅的熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 隨訪

所有患者均采用電話隨訪隨訪，隨訪時間5年，生存期為患者確診時間至死亡或最后隨訪的時間，失訪患者生存期計算至末次隨訪日。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析處理，生存分析采用Kaplan-Meier法計算生存率，log-rank法進行各組間的生存比較。計量資料比較用（），組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料統(tǒng)計分析采用x2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MM患者血清HSP90和P23蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果

在正常以及應(yīng)急情況下，HSP90大多位于胞漿內(nèi)，然而，細胞外也存在分泌型HSP90，采用ELISA法檢測42例MM患者血清HSP90和P23蛋白濃度，結(jié)果顯示：MM患者HSP90血清濃度明顯比正常人增高（23682.73±15834.96） vs（4209.70±890.69），P=0.001<0.05，而且GC敏感組患者較GC抵抗組患者高（34372.64±9050.07）vs（11247.64±10654.64），P=0.01<0.05，但是，各組P23血清濃度沒有明顯差異（37.37±0.10）vs（43.36±25.10），P=0.38>0.05。這提示MM患者血清HSP90蛋白濃度升高具有特異性，可作為生物標記物。見圖1。

2.2 HSP90和P23蛋白在MM1.S，MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗的MM患者亞細胞定位

采用細胞免疫熒光分析方法，檢測了HSP90和P23蛋白在MM1.S，MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗MM患者亞細胞定位，結(jié)果顯示：MM1.S，MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗的MM患者外周血細胞單個核細胞中，HSP90和P23蛋白都定位于胞漿，核內(nèi)無此蛋白表達。見圖2。

2.3 P23蛋白表達與MM患者對GC治療療效的關(guān)系

在原先研究的基礎(chǔ)上，擴大病例數(shù)，采用Western Blot方法檢測了40例MM患者PBMNC中HSP90和P23蛋白表達。P23蛋白低表達28例，含GC聯(lián)合方案治療有效者24例，有效率為86%，無效者4例，無效率為14%；P23蛋白高表達者12例，含GC聯(lián)合方案治療有效者2例，有效率為33%，無效者10例，無效率為67%，二者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這提示P23蛋白表達量能預(yù)測GC敏感性。見圖3。

2.4 P23蛋白表達與患者生存率的關(guān)系

隨訪40例MM患者，隨訪時間最長60個月，中位隨訪時間27.5個月（5～60個月），部分患者失訪，P23蛋白低表達和P23蛋白高表達MM患者平均生存時間分別為55.8個月和44.4個月，log-rank檢驗結(jié)果顯示P23蛋白低表達MM患者5年生存率明顯高于P23蛋白高表達的MM患者（78.6% vs 42.9%，P=0.007<0.05）。見圖4。

3 討論

VAD方案是治療MM最主要方案之一，其反應(yīng)率50%～60%，地塞米松（Dex）在此方案的貢獻率80%，其他聯(lián)合化療方案中大多數(shù)也有Dex，因此能預(yù)測MM患者對GC的敏感性就顯得尤其重要。我們在前期體外實驗中觀察到Dex敏感細胞株MM1.S和Dex抵抗細胞珠MM1.R對Dex敏感性有明顯的差異性[1]，GRα，IkB-α和HSP90蛋白表達無差異性，但是P23蛋白表達在MM1.S、MM1.R細胞珠、MM患者和正常人中存在明顯的差異性，而且從Brian Freeman和Keith Yamamoto[4]兩位學者研究報告也給了我們重要的啟發(fā)，即HSP90以及輔分子伴侶P23是否是調(diào)控GC抵抗的另一種主要分子呢？因此，順此思路，觀察是否MM患者HSP90和P23蛋白分子有可能作為預(yù)測GC敏感性指標。endprint

近來研究顯示細胞胞外也有HSP90分子存在[5-6]，Xiaofeng Wang等[7]發(fā)現(xiàn)荷瘤鼠HSP90血清濃度較正常鼠增高，而且HSP90是由腫瘤細胞分泌的，檢測6例肝癌患者血清HSP90濃度后發(fā)現(xiàn)顯著高于正常人，并證實絕大多數(shù)其他種類腫瘤患者HSP90血清濃度都高于設(shè)定的閾值（50ng/mL），而良性腫瘤患者HSP90血清濃度與正常人沒有差異。Anjian Xu等[8-9]觀察小細胞肺癌患者血清HSP90水平也升高，而且隨著腫瘤分期級別增高而增高，采用Western Blot法檢測人肺腺癌細胞珠CL1-0和CL1-5無血清培養(yǎng)介質(zhì)中HSP90α蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)CL1-5培養(yǎng)介質(zhì)中HSP90α蛋白表達量明顯高于CL1-0細胞珠的HSP90α蛋白表達量，作者認為HSP90可作為肺癌患者診斷和預(yù)后判斷的血清生物標記物。但也有相悖的研究結(jié)果，F(xiàn)lorazagouri等[10-11]發(fā)現(xiàn)血清HSP90水平與乳腺管和腺體損害程度無相關(guān)性。那么MM患者血清中是否也能檢測到HSP90，它的臨床意義如何？我們采用ELISA法檢測MM患者血清HSP90濃度，結(jié)果顯示MM患者HSP90血清濃度明顯高于正常對照組，GC敏感組患者高于GC抵抗組患者，然而，各組血清P23濃度無差異性。

P23在腫瘤中的作用是多方面的，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者P23蛋白高表達[12-14]，而且腫瘤轉(zhuǎn)移患者的P23蛋白表達增高，此外，P23使哺乳動物細胞對HSP90抑制劑和化療藥物格爾德霉素不敏感，從而使得HSP90蛋白及其他復(fù)合物結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定[15-16]。P23蛋白高表達乳腺癌患者其腫瘤細胞易轉(zhuǎn)移，易產(chǎn)生耐藥性，患者生存期短，P23蛋白既存在于乳腺癌細胞珠MCF-7的細胞核內(nèi)，也存在于細胞漿，胞漿P23高表達患者其生存期較短，以上說明P23分子在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著一定作用[17]。我們試圖通過觀察HSP90和P23蛋白在細胞定位來間接判斷MM患者對GC的敏感性，但遺憾的是MM1.S，MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗的MM患者外周血細胞單個核細胞中，HSP90和P23蛋白都定位于胞漿，核內(nèi)無此蛋白表達，細胞免疫熒光法是否粗略，采用共聚焦顯微鏡成像法可能更精密，這有待以后實驗證明。我們還觀察了P23蛋白表達與臨床相關(guān)性，結(jié)果顯示P23蛋白表達與GC敏感性和疾病生存期長短有相關(guān)性，盡管病例數(shù)不多，但它首次提出了可用HSP90和P23兩項指標預(yù)測MM患者GC敏感性。

總之，我們的研究結(jié)果顯示血清HSP90濃度和P23蛋白表達可預(yù)測MM患者GC敏感性和疾病生存期，尋求降低P23蛋白表達的藥物從而為逆轉(zhuǎn)GC抵抗，進一步提高MM患者的化療療效是非常重要的，因此，以P23為靶向治療有望逆轉(zhuǎn)化療藥物抵抗，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，提高MM患者生存期。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-03-27）endprint

近來研究顯示細胞胞外也有HSP90分子存在[5-6]，Xiaofeng Wang等[7]發(fā)現(xiàn)荷瘤鼠HSP90血清濃度較正常鼠增高，而且HSP90是由腫瘤細胞分泌的，檢測6例肝癌患者血清HSP90濃度后發(fā)現(xiàn)顯著高于正常人，并證實絕大多數(shù)其他種類腫瘤患者HSP90血清濃度都高于設(shè)定的閾值（50ng/mL），而良性腫瘤患者HSP90血清濃度與正常人沒有差異。Anjian Xu等[8-9]觀察小細胞肺癌患者血清HSP90水平也升高，而且隨著腫瘤分期級別增高而增高，采用Western Blot法檢測人肺腺癌細胞珠CL1-0和CL1-5無血清培養(yǎng)介質(zhì)中HSP90α蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)CL1-5培養(yǎng)介質(zhì)中HSP90α蛋白表達量明顯高于CL1-0細胞珠的HSP90α蛋白表達量，作者認為HSP90可作為肺癌患者診斷和預(yù)后判斷的血清生物標記物。但也有相悖的研究結(jié)果，F(xiàn)lorazagouri等[10-11]發(fā)現(xiàn)血清HSP90水平與乳腺管和腺體損害程度無相關(guān)性。那么MM患者血清中是否也能檢測到HSP90，它的臨床意義如何？我們采用ELISA法檢測MM患者血清HSP90濃度，結(jié)果顯示MM患者HSP90血清濃度明顯高于正常對照組，GC敏感組患者高于GC抵抗組患者，然而，各組血清P23濃度無差異性。

P23在腫瘤中的作用是多方面的，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者P23蛋白高表達[12-14]，而且腫瘤轉(zhuǎn)移患者的P23蛋白表達增高，此外，P23使哺乳動物細胞對HSP90抑制劑和化療藥物格爾德霉素不敏感，從而使得HSP90蛋白及其他復(fù)合物結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定[15-16]。P23蛋白高表達乳腺癌患者其腫瘤細胞易轉(zhuǎn)移，易產(chǎn)生耐藥性，患者生存期短，P23蛋白既存在于乳腺癌細胞珠MCF-7的細胞核內(nèi)，也存在于細胞漿，胞漿P23高表達患者其生存期較短，以上說明P23分子在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著一定作用[17]。我們試圖通過觀察HSP90和P23蛋白在細胞定位來間接判斷MM患者對GC的敏感性，但遺憾的是MM1.S，MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗的MM患者外周血細胞單個核細胞中，HSP90和P23蛋白都定位于胞漿，核內(nèi)無此蛋白表達，細胞免疫熒光法是否粗略，采用共聚焦顯微鏡成像法可能更精密，這有待以后實驗證明。我們還觀察了P23蛋白表達與臨床相關(guān)性，結(jié)果顯示P23蛋白表達與GC敏感性和疾病生存期長短有相關(guān)性，盡管病例數(shù)不多，但它首次提出了可用HSP90和P23兩項指標預(yù)測MM患者GC敏感性。

總之，我們的研究結(jié)果顯示血清HSP90濃度和P23蛋白表達可預(yù)測MM患者GC敏感性和疾病生存期，尋求降低P23蛋白表達的藥物從而為逆轉(zhuǎn)GC抵抗，進一步提高MM患者的化療療效是非常重要的，因此，以P23為靶向治療有望逆轉(zhuǎn)化療藥物抵抗，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，提高MM患者生存期。

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[17] Natalie ES， Marcus Lambert W， Renecia Watkins， et al.High levels of HSP90 cochaperone P23 Promotes tumor progression and poor prognosis in breast cancer by increasing lymph node metastases and drug resistance[J]. Cancer Res，2010，70（21）： 8446-8456.

（收稿日期：2014-03-27）endprint

近來研究顯示細胞胞外也有HSP90分子存在[5-6]，Xiaofeng Wang等[7]發(fā)現(xiàn)荷瘤鼠HSP90血清濃度較正常鼠增高，而且HSP90是由腫瘤細胞分泌的，檢測6例肝癌患者血清HSP90濃度后發(fā)現(xiàn)顯著高于正常人，并證實絕大多數(shù)其他種類腫瘤患者HSP90血清濃度都高于設(shè)定的閾值（50ng/mL），而良性腫瘤患者HSP90血清濃度與正常人沒有差異。Anjian Xu等[8-9]觀察小細胞肺癌患者血清HSP90水平也升高，而且隨著腫瘤分期級別增高而增高，采用Western Blot法檢測人肺腺癌細胞珠CL1-0和CL1-5無血清培養(yǎng)介質(zhì)中HSP90α蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)CL1-5培養(yǎng)介質(zhì)中HSP90α蛋白表達量明顯高于CL1-0細胞珠的HSP90α蛋白表達量，作者認為HSP90可作為肺癌患者診斷和預(yù)后判斷的血清生物標記物。但也有相悖的研究結(jié)果，F(xiàn)lorazagouri等[10-11]發(fā)現(xiàn)血清HSP90水平與乳腺管和腺體損害程度無相關(guān)性。那么MM患者血清中是否也能檢測到HSP90，它的臨床意義如何？我們采用ELISA法檢測MM患者血清HSP90濃度，結(jié)果顯示MM患者HSP90血清濃度明顯高于正常對照組，GC敏感組患者高于GC抵抗組患者，然而，各組血清P23濃度無差異性。

P23在腫瘤中的作用是多方面的，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者P23蛋白高表達[12-14]，而且腫瘤轉(zhuǎn)移患者的P23蛋白表達增高，此外，P23使哺乳動物細胞對HSP90抑制劑和化療藥物格爾德霉素不敏感，從而使得HSP90蛋白及其他復(fù)合物結(jié)構(gòu)功能穩(wěn)定[15-16]。P23蛋白高表達乳腺癌患者其腫瘤細胞易轉(zhuǎn)移，易產(chǎn)生耐藥性，患者生存期短，P23蛋白既存在于乳腺癌細胞珠MCF-7的細胞核內(nèi)，也存在于細胞漿，胞漿P23高表達患者其生存期較短，以上說明P23分子在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起著一定作用[17]。我們試圖通過觀察HSP90和P23蛋白在細胞定位來間接判斷MM患者對GC的敏感性，但遺憾的是MM1.S，MM1.R細胞株以及GC敏感和抵抗的MM患者外周血細胞單個核細胞中，HSP90和P23蛋白都定位于胞漿，核內(nèi)無此蛋白表達，細胞免疫熒光法是否粗略，采用共聚焦顯微鏡成像法可能更精密，這有待以后實驗證明。我們還觀察了P23蛋白表達與臨床相關(guān)性，結(jié)果顯示P23蛋白表達與GC敏感性和疾病生存期長短有相關(guān)性，盡管病例數(shù)不多，但它首次提出了可用HSP90和P23兩項指標預(yù)測MM患者GC敏感性。

總之，我們的研究結(jié)果顯示血清HSP90濃度和P23蛋白表達可預(yù)測MM患者GC敏感性和疾病生存期，尋求降低P23蛋白表達的藥物從而為逆轉(zhuǎn)GC抵抗，進一步提高MM患者的化療療效是非常重要的，因此，以P23為靶向治療有望逆轉(zhuǎn)化療藥物抵抗，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，提高MM患者生存期。

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