誘導神經干細胞的研究進展及應用前景

綜述與專論

誘導神經干細胞的研究進展及應用前景

唐璽和，陳志國，張愚

(首都醫科大學宣武醫院細胞治療中心，北京100053)

【摘要】誘導神經干細胞(induced neural stem cells,iNSCs)是通過在成體細胞內轉入特定外源因子而獲得。目前主要有兩種途徑獲得iNSCs,即直接誘導法和間接誘導法(需經歷重編程過程中不穩定的中間狀態)。與誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)比較，iNSCs直接將成體細胞重編程為神經干細胞，而不經過iPSCs再分化為神經干細胞，可減少其致瘤性，縮短誘導周期,提高轉分化效率，這將使其更適于臨床應用。本文就iNSCs的研究進展，應用前景加以綜述。

【關鍵詞】誘導神經干細胞；體細胞重編程；誘導多能干細胞；治療

[基金項目]973計劃重點項目(2012CBA01307)帕金森氏病干細胞治療的研究。

[作者簡介]唐璽和(1981-)男，博士研究生，研究方向：誘導神經干細胞治療帕金森氏病。

[通訊作者]陳志國(1977-)，研究員，博士生導師，研究方向：神經退行性疾病的干細胞治療。Email：chenzhiguo2999@yahoo.cn；張愚(1967-)，研究員，博士生導師，研究方向：帕金森氏病的神經干細胞治療。Email:yaz@bjsap.org。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.016

Advances and application of induced neural stem cells

TANG Xi-he, CHEN Zhi-guo, ZHANG Yu

(Cell Therapy Center, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China)

Abstract【】It has been reported that induced neural stem cells(iNSCs) can be obtained from rodent and human somatic cells through the forced expression of defined factors. Two different approaches have been successfully used to obtain iNSCs:a direct method and an indirect method which involves an unstable intermediate state.Compared with induced pluripotent stem cells (iPSCs) and embryonic stem cells(ESCs)，iNSCs are committed towards neural lineage, enabling them with a lower risk of tumorigenicity and more efficient transdifferentiation which makes it suitable for clinical use in the future.

【Key words】Induced neural stem cells; Somatic cell reprogramming;Induced pluripotent stem cells; Therapy

干細胞為許多神經系統疾病治療帶來希望，比如帕金森氏病[1]，肌萎縮性脊髓側索硬化癥[2]，老年性癡呆[3]及脊髓外傷性[4-6]疾病。長期以來，科研人員試圖使用外科技術或者立體定向技術將ESCs(胚胎干細胞)或者由其分化到某一階段的神經細胞移植到病變部位，使其定植并產生功能，達到治療作用。大量研究表明，使用胚胎干細胞治療帕金森病、脊髓損傷及糖尿病有一定作用，但胚胎干細胞的致瘤性，異體移植的免疫排斥以及倫理學爭議限制其應用。2006年，Yamanaka利用小鼠成纖維細胞成功獲得iPSCs，開創了干細胞研究的新局面[7]，該研究使自體干細胞移植成為可能。2007年，Yamanaka[8]及Wernig[9]報道了由人成纖維細胞獲得iPSCs，之后iPSCs治療相關疾病的細胞模型及動物模型也成功建立，為iPSCs向臨床應用做了大量前期工作。但是，研究發現，iPSCs用于臨床治療還面臨很多問題，如致瘤性，定向分化效率低，安全性問題。因此，將體細胞直接誘導為成體干細胞，而不經過iPSCs階段，以減少其致瘤性，提高分化效率成為研究熱點。

1體外獲得iNSCs的方法

目前誘導神經干細胞方法主要分為直接誘導法和間接誘導法。直接誘導即在成體細胞內轉入神經干細胞表達的特定外源基因，microRNAs或者小分子蛋白等，直接獲得iNSCs。間接誘導：在成體細胞重編程為iPSCs過程中(可以稱之為中間狀態或者不穩定狀態)，改變誘導環境，使其成為iNSCs。

1.1成體細胞直接重編程為神經干細胞或者神經前體細胞

該方法主要是在成體細胞中直接轉入神經干細胞表達的某些相關基因，使其直接重編程為神經干細胞。Lujan[10]等報道轉入11個神經干細胞相關的外源基因可以將小鼠成纖維細胞誘導成神經干細胞，該細胞在體外可以分化出星形膠質細胞，少突膠質細胞及成熟神經元，并能在體內存活。Sheng C等[11]轉入Ascl1、Ngn2、Hes5等9個神經干細胞相關基因將小鼠睪丸支持細胞誘導成神經干細胞，該細胞在體外能分化出多巴胺能神經元，膽堿能神經元及神經膠質細胞。Han等[12]報轉入Brn4、sox2、klf4、c-Myc、E47基因或轉入Brn4、sox2、klf4、c-Myc均將小鼠成纖維細胞誘導為神經干細胞，誘導神經干細胞能在體外在傳代130次以上，且與野生型神經干細胞形態，基因表達，十分相似。研究還發現轉入4因子與5因子誘導的神經干細胞與野生型神經干比較，同樣有成熟的分化能力，可分化出星形膠質細胞、神經元、少突膠質細胞。Ring等[13]用逆轉錄病毒載體攜帶sox2轉染小鼠成纖維細胞，6～10 d后就出現神經干細胞克隆。而轉染人成纖維細胞后，5 d內就出現了神經干細胞克隆，將誘導神經干細胞與野生型神經干細胞同時移植免疫缺陷小鼠，沒有腫瘤形成，證明誘導神經干細胞的安全性。Saiyong Zhu[14]等只使用OCT4單個基因聯合A83-01、CHIR99021、NaB、LPA、rolipram、SP600125成功的將人成纖維細胞誘導為神經干細胞，經過4周體外自然分化，能分化出成熟的神經元。移植小鼠腦內后，該細胞能向神經元分化，且無腫瘤形成。Kim SM 等利用逆轉錄病毒攜帶Klf4、c-Myc、Sox2、Brn4轉染小鼠成纖維細胞，4周后獲得誘導神經干細胞，神經干細胞無成瘤性[15]。

1.2成體細胞經過iPSCs中間狀態誘導為神經干細胞，即在成體細胞中轉入經典Yamanaka 四因子(或者略加減)后，在iPSCs誘導的早期改變培養基，使其能向神經干細胞方向發展

Kim等[16]使用Dox載體系統在小鼠成纖維細胞中轉入oct4、sox2、klf4、c-myc基因，在含有LIF的MEF上培養3～6 d后繼續在神經干細胞培養基中培養8～9 d，將會有表達plzf、pax6等神經干細胞標志的克隆出現，這種“類似神經干”細胞，可以繼續分化出星形膠質細胞、神經元，但是此種干細胞在體外只能擴增3～5代。裴端卿等[17]使用非整合載體oriP/EBNA episomal攜帶oct4、sox2、sv40lt、klf4和microRNA302-367 電轉人尿液中提取的活細胞，然后在神經干細胞培養基中加入CHIR99021、PD0325901、A83-01、Thiazoviv、DMH1，電轉后12 d可見神經干細胞克隆出現，且能表sox1、sox2、pax6等神經干細胞標志性基因，誘導的神經干細胞能分化成星形膠質細胞，多巴胺能神經元，谷氨酸能神經元，但是不能自然分化為少突膠質細胞，在使用PDGF-AA、NT3等小分子刺激后，可以分化出少突膠質細胞。同時，將誘導神經干細胞移植入新生小鼠紋狀體后，神經干細胞能夠存活，遷移，腦內沒有形成腫瘤，證明誘導神經干細胞的體外分化能力及安全性。張素春等[18]等使用仙臺病毒為載體，將oct4、sox2、klf4、c-Myc轉入人成纖維細胞，在神經干細胞培養基中加入LIF、CHIR99021、SB431542三個小分子，之后通過升高培養溫度(39℃)使得仙臺病毒滅火，第13天可見神經干細胞克隆形成。其表達nestin、sox1、sox2、fabp7、pax6、hes5、notch1等神經干細胞的標志性基因，并且在體外可以分化為星形細胞，神經元及少突膠質細胞，該類細胞還具有腦區特異性。目前經iPSCs中間狀態誘導神經干細胞的方法受到推崇，因為其誘導體系隨著誘導iPSCs體系變革而更加安全。此前誘導iPSCs方法的缺點主要是向供體細胞中引入外源基因，且病毒轉染時可能將外源基因整合到細胞基因組中，導致供體細胞基因突變，另外，c-Myc，Klf4是致癌基因，可以增加細胞的成瘤性，因此，提高iPSCs的安全性主要在轉入因子選擇及載體的進一步改進。Nakagawa M等[19]在無c-Myc下將體細胞重編程為iPSCs，降低了iPSCs的成瘤性。Anokye-Danso等[20]采用miRNAs在無轉錄因子作用下直接誘導iPSCs。鄧宏魁等[21]單純使用化學小分子成功誘導出iPSCs，提供了更加安全的誘導系統。另外，除了成纖維細胞做為供體細胞外，Loh Y.HStaerk,JDowey SN等[22-24]使用外周血中的T細胞或單個核細胞成功誘導出iPSCs，免去了獲取成纖維細胞的侵襲性操作，這也提示了使用外周血單核細胞誘導神經干細胞的可能性。

2誘導神經干細胞的優點及應用前景

2.1安全性與多能性的統一

神經干細胞移植被認為是治療很多神經變性疾病及神經退行性疾病的新方法，除了病變神經細胞的功能替代，干細胞釋放的神經保護因子及生長因子對疾病治療也有作用。目前開展的動物實驗模型有帕金森病[1, 25]，亨廷頓舞蹈癥[26]，多發性硬化[27]，腦卒中[28]及脊髓損傷[29]等，實驗結果顯示干細胞治療效果明顯，但是其用于臨床治療的效果并不明顯,這可能與移植細胞的數量，移植方法等有關系[30-33]。ESCs細胞與iPSCs具有多向分化能力，移植后成瘤性強[34]，而誘導神經干細胞具有分化的特異性，主要向星形膠質細胞，少突膠質細胞，神經元方向分化，其致瘤性下降[35]。與成體細胞相比，神經干細胞在移植后仍然能維持自我更新及多向分化能力，對于腦神經損傷及脊髓損傷這種并非只是單一神經細胞病變的疾病，使用誘導神經干細胞治療更加合適[36, 37]。

2.2誘導自體神經干細胞減少移植免疫排斥

同ESCs細胞及其他供體來源干細胞移植相比，iPSCs與誘導神經干細胞可來自本體，能減少免疫排斥反應。但是經過細胞重編程，外源基因插入以及某些自體基因被修飾，使得自體iPSCs移植仍然存在免疫反應[38]，iNSCs是否因為某些基因表達不同而較iPSCs引起移植后免疫反應減弱，需要進一步探討。由供體細胞獲得誘導神經干細胞需要一定周期，這對一些慢性疾病影響較小，但對于存在治療時間窗的急性疾病，如腦卒中，將影響其臨床應用。

2.3誘導周期縮短及分化效率提高

與iPSCs相比較，誘導神經干細胞周期明顯縮短[10，12，13]，盡管誘導神經干細胞效率不高，但其能在體外快速擴增，數量能夠滿足臨床需求，而且更易分化為神經細胞。而由iPSCs分化神經干細胞，需要經歷不同的分化階段，耗時，且所得細胞并非處同一分化階段，單一細胞純度不高[34]，這是iPSCs臨床應用前要解決的問題。

目前，誘導神經干細胞研究主要集中在如何縮短體細胞轉分化的周期及提高轉分化效率，以及外源因子載體的安全性，移植治療的有效性。另外，病變部位細胞原位轉分化為神經干細胞以起到治療作用也是很有意義的研究方向。

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〔修回日期〕2014-11-05