ARHI基因在胰腺癌細胞中的抑癌作用及其機制研究

路新卿，張文嫻，李校天，翟建文，沈香榮，劉志軍(河北工程大學附屬醫院消化內科，河北 邯鄲 056002)

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·論著·

ARHI基因在胰腺癌細胞中的抑癌作用及其機制研究

路新卿，張文嫻，李校天，翟建文，沈香榮，劉志軍*(河北工程大學附屬醫院消化內科，河北 邯鄲 056002)

[摘要]目的觀察ARHI基因對人胰腺癌細胞株(PANC-1和MiaPaCa-2細胞株)生長的影響，探討其抑制細胞生長的作用機制。方法采用脂質體轉染和G418篩選方法建立ARHI基因穩定表達的PANC-1、MiaPaCa-2細胞株，并通過Western blot方法驗證ARHI基因在穩定細胞株中蛋白表達；通過生長曲線方法分析ARHI基因對胰腺癌細胞增殖的影響；應用Western blot方法檢測ARHI基因對PI3K/AKT信號轉導通路的蛋白表達。結果目的基因組PANC-1、MiaPaCa-2細胞株有ARHI蛋白的表達，無轉染組和空載體組無ARHI 蛋白表達；隨時間延長，無轉染組、空載體組和目的基因組細胞生長均呈增長趨勢，目的基因組細胞生長速度最慢，差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)；與空載體組比較，目的基因組蛋白表達后顯著下調了PI3K/AKT信號通路中p-AKT蛋白的表達。結論ARHI可以明顯抑制胰腺癌細胞的生長，下調與腫瘤發生相關的PI3K/AKT信號傳導通路，可能在胰腺癌的發生發展中起了重要的作用。

[關鍵詞]胰腺腫瘤；基因表達;細胞增殖

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.003

胰腺癌的5年存活率僅為3%[1]，病死率和發病率十分接近(0.99∶1)，在確診時，僅10% ～20%患者可以手術切除，且預后很差[2]。近來研究表明，在胰腺細胞惡變過程中，伴隨著許多基因的突變或缺失(如K-ras、p53等)，從而在各個環節影響細胞信號正常傳遞過程，引起信號轉導的異常與障礙，最終導致胰腺癌的發生[3]。ARHI(aplysia ras homolog I)基因作為腫瘤抑制基因，屬于Ras超家族成員，但與大部分Ras家族成員都是癌基因不同，ARHI具有抑癌作用[4]。磷脂酰肌醇-3-羥基激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/絲氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase，AKT)通路是Ras的經典通路之一，是Ras維持細胞生存和抑制凋亡的關鍵途徑，在胰腺癌變過程中起著重要的作用[5]。本研究旨在探討ARHI是否通過與Ras共同的PI3K/ AKT信號通路，抑制胰腺癌細胞的增殖和負向調節細胞生長的機制。報告如下。

1資料與方法

1.1細胞及試驗 人胰腺癌細胞株PANC-1、MiaPaCa-2(北京協和醫院)，細胞增殖檢測試劑(普利萊基因技術有限公司)，細胞轉染試劑LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司，美國)，RNA酶(RNase)、變性/非變形細胞裂解緩沖液、BCA法蛋白質定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)，Western blot 實驗試劑(普利萊基因技術有限公司)，ARHI兔抗人多克隆抗體和ARHI小鼠抗人單克隆抗體(復旦大學郁蔭華教授饋贈)，β-Actin兔抗人多克隆抗體(Santa Cruze公司，美國)，AKT、p-AKT兔抗人多克隆抗體(Cell Sigalling Technology USA)。

1.2細胞培養胰腺癌細胞培養于含胎牛血清的高糖培養基中，當70%～80%細胞融合時予以傳代，培養瓶中加入胰酶后，孵箱中消化細胞3～5 min，棄消化液，加入培養基吹打瓶壁上細胞，形成均勻單細胞懸液，計數，按所需濃度轉移至新培養瓶或培養板中，進行實驗研究。

1.3細胞分組①對照組：正常胰腺組織；②無轉染組：細胞無轉染質粒；③空載體組：細胞轉染核糖體內部位點增強型綠色熒光蛋白(internal ribosome entry site2-enhanced green fluorescent protein,pIRES2-EGFP)質粒；④目的基因組：細胞轉染核糖體內部位點增強型綠色熒光蛋白ARHI (internal ribosome entry site2-enhanced green fluorescent protein aplysia ras homolog I,pIRES2-EGFP-ARHI)質粒。

1.4穩定轉染胰腺癌細胞株的建立提取pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-ARHI質粒，應用LipofectamineTM 2000脂質體瞬時轉染PANC-1、MiaPaCa-2胰腺癌細胞，新霉素(Neomycin418,G418)藥物篩選瞬時轉染的細胞，第12～14天時，PANC-1和MiaPaCa-2細胞大部分細胞已死亡，G418濃度減為半量，繼續維持篩選壓力。熒光顯微鏡下可見散在綠色熒光細胞，建立了穩定表達ARHI基因和空載體的胰腺癌細胞株。

1.5實驗細胞的準備和蛋白提取接種轉染空載體和目的基因ARHI的PANC-1和 MiaPaCa-2細胞3×105個于6孔板中，實驗前1 d，細胞換為無血清培養基培養24 h后，分別于實驗前加入表皮生長因子(epithelial growth factor，EGF)終濃度為50 μg/L刺激不同的時間(0、15、30、60 min)，觀察 p-AKT和AKT蛋白表達情況，胰腺癌組織或細胞加入蛋白裂解液，孵育20 min，離心，取上清至離心管中，進行蛋白定量和濃度測定。

1.6蛋白的檢測制備SDS-PAGE凝膠，樣品變性及電泳，轉膜，封閉、抗體孵育及曝光等步驟進行檢測。

1.7細胞增殖檢測接種1×105個PANC-1和MiaPaCa-2細胞于6孔板，分別于0、1、2、3、4、5 d時應用臺盤藍染色后進行活細胞計數。在熒光顯微鏡下觀查細胞生長情況，每天取出細胞進行計數，每組細胞數取出3孔進行計數，計算均值。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，重復3次，繪制PANC-1和MiaPaCa-2細胞增殖曲線。

1.8統計學方法應用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析，計量資料比較采用重復測量設計資料的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1穩定表達多克隆胰腺癌細胞株的熒光表現G418藥物進行篩選，14 d后，篩選出穩定表達pIRES2-EGFP-ARHI(ARHI)和pIRES2-EGFP(Vector)基因多克隆胰腺癌細胞株(圖1，2)，熒光顯微鏡下可見大量的綠色熒光。

2.2Western blot檢測ARHI蛋白表達無轉染組和空載體組胰腺癌細胞無ARHI蛋白表達(ARHI蛋白相對分子質量為26 000)，目的基因組胰腺癌細胞株和對照組胰腺組織可見ARHI蛋白表達(圖3)。

圖1 表達Vector和ARHI基因的PANC-1多克隆胰腺癌細胞株的熒光表現(×40)A.pIRES2-EGFP質粒;B.pIRES2-EGFP-ARHI質粒Figure1 StabletransfectedPANC-1pancreaticcancercelllinethatexpressedAR-HIandemptyvector(×40)圖2 表達Vector和ARHI基因的MiaPaCa-2多克隆胰腺癌細胞株熒光表現(×40)A.pIRES2-EGFP質粒;B.pIRES2-EGFP-ARH質粒Figure2 StabletransfectedMiaPaCa-2pancreaticcancercelllinethatexpressedARHIandemptyvector(×40)

圖3PANC-1、MiaPaCa-2細胞中的ARHI蛋白表達

0.對照組；1、4．無轉染組；2、5.空載體組；3、6.目的基因組

Figure 3The expression of ARHI protein in PANC-1、MiaPaCa-2 stable transfected pancreatic cancer cell line

2.3穩定轉染胰腺癌細胞株的生長曲線將無轉染組、空載體組和目的基因組的PANC-1、MiaPaCa-2細胞以每孔1×105個接種于6孔細胞培養板。隨時間延長，各組細胞株均呈增加趨勢，無轉染組增加最快，目的基因組增加最緩慢，組間、時點間、組間·時點間交互作用比較差異有統計學意義(P<0.05或<0.01)。見表1，2。

表1ARHI對PANC-1細胞生長的影響

Table 1The effect of ARHI on the growth of stable transfected PANC-1 cell

組別 PANC-1細胞第0天第1天第2天第3天第4天第5天無轉染組 11.12±0.052.34±0.135.53±0.209.45±0.3312.9±1.05空載體組 11.00±0.031.86±0.143.36±0.165.20±0.898.52±0.42目的基因組 10.87±0.031.07±0.051.67±0.102.07±0.152.85±0.16組間 F=18.020 P=0.000時點間 F=19.740 P=0.000組間·時點間F=23.380 P=0.000

表2ARHI對MiaPaCa-2細胞生長的影響

Table 2The effect of ARHI on the growth of stable transfected MiaPaCa-2 cell

組別 MiaPaCa-2細胞第0天第1天第2天第3天第4天第5天無轉染組 11.23±0.063.70±0.207.60±0.9322.60±2.3152.70±3.70空載體組 11.19±0.143.30±0.296.36±0.2412.10±1.1120.50±2.24目的基因組 10.90±0.051.35±0.142.03±0.173.16±0.184.73±0.40組間 F=4.460 P=0.0380時點間 F=25.240 P=0.0000組間·時點間F=36.910 P=0.0000

2.4ARHI基因與PI3K/AKT相關信號轉導應用EGF=50 μg/L分別刺激0、15、30和60 min后，觀察磷酸化AKT(p-AKT)和總AKT(T-AKT)的表達。結果表明，目的基因組胰腺癌細胞轉染ARHI基因后，與空載體組比較，磷酸化的p-AKT蛋白表達明顯下調，T-AKT蛋白表達沒有變化。ARHI基因下調了p-AKT的表達(圖4)。圖4ARHI基因對胰腺癌PANC-1、MiaPaCa-2細胞PI3K/AKT通路的影響

Figure 4The effect of tumor suppression ARHI on PI3K/AKT pathway

3討論

現有資料表明，胰腺癌的發生是多基因參與、多階段累積漸進的復雜過程。癌基因激活和抑癌基因失活是腫瘤發生最基本的分子事件，這會導致細胞生長失控而發生癌變。在細胞癌變過程中，經常出現1個或多個抑癌基因的缺失，表明抑癌基因失活參與了胰腺癌的發生。ARHI是母源性印跡的抑癌基因，屬于Ras超家族中的一員，但與Ras不同，具有抑癌作用。前期研究結果表明將ARHI基因轉染導入該基因表達缺失的胰腺癌細胞，可以誘導胰腺癌細胞凋亡[6]，其作用可抑制有絲分裂活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號通路，降低信號傳導及轉錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT3)的活性[7]。

前期工作通過瞬時轉染對ARHI基因的作用進行了初步研究，在此基礎上，期望建立穩定表達ARHI基因胰腺癌細胞株，進一步詳細地研究ARHI基因在胰腺癌中的功能和作用。選擇了細胞株PANC-1和MiaPaCa-2是ARHI表達缺失的細胞株。在瞬時轉染48 h后，通過G418篩選的方法，大概在篩選12～14 d后，無轉染的細胞幾乎全部死亡，G418濃度減半，繼續維持篩選壓力，大概在18～20 d，建立了可以滿足實驗要求的ARHI表達胰腺癌細胞株。通過RT-PCR 和Western blot的方法，在基因和蛋白水平上驗證了穩定轉染胰腺癌細胞株ARHI基因的表達，建立了穩定表達ARHI基因多克隆胰腺癌細胞株，這為下一步的研究奠定了基礎。

ARHI基因是Ras超家族中第1個發現的抑癌基因，用脂質體包裹ARHI基因正義導入卵巢癌細胞株OVCA433、OVCA429、Hey后具有明顯的克隆生長抑制作用。Wang等[8]發現ARHI基因在結腸癌中表達降低，與結腸癌的發生有明顯的關系。Yu等[9]研究證明ARHI基因在腎癌細胞中表達明顯降低，ARHI基因可以明顯抑制腎癌細胞的生長，在腎癌細胞是一個腫瘤抑制基因。將人上皮性卵巢癌細胞株細胞種植于裸鼠皮下成瘤后半包埋縫于裸鼠脾區網膜建立網膜移植瘤模型，將GE7-β-gal 四元復合體經腹腔注入荷瘤鼠體內，ARHI基因導入治療后瘤體明顯小于空質粒對照組，核分裂相亦減少，實驗組與空質粒對照組的抑瘤率分別為40.81% 和16.90%，癌組織的有絲分裂指數亦表明該基因治療可阻止癌細胞進入分裂期，減少從而抑制卵巢癌生長。將人的ARHI基因轉入FVB/B鼠體內,ARHI在肌肉、腎臟、腦、肺等都有表達，發現轉基因鼠比對照組體質量低10%～40%。還有研究發現ARHI在正常胰腺組織中高表達，而在胰腺癌組織中表達明顯降低，與胰腺癌的發生有著密切的關系[10]。

本研究接種了表達空載體和ARHI基因的胰腺癌細胞，觀察了接種1～5 d細胞生長情況，繪制細胞增殖曲線?？梢娔康幕蚪M細胞生長明顯減慢，增殖抑制最明顯。表明ARHI基因具有抑制胰腺癌細胞增殖的作用，體現了ARHI作為抑癌基因的特點。同樣，從MiaPaCa-2細胞的生長曲線數據分析，我們可以得出相同的結論。

多年來，探討Ras相關的信號傳導通路始終是研究腫瘤的熱點。大量研究表明Ras信號傳導通路在調控正常細胞生長和惡性腫瘤轉化過程中起著十分重要的作用，Ras啟動的下游信號傳導途徑中，最經典的2條通路一是Ras-Raf-MAPKK-MAPK途徑，另一個是PI3K/AKT途徑，該信號通路在調節細胞生長和增殖方面起著與Ras-Raf-MAPKK-MAPK途徑同等重要的作用，參與了許多信號通路的調節，并且對腫瘤中許多異常調節的過程有深遠的影響[11-12]。刺激信號激活Ras后，可通過Ras上調PI3K/AKT通路的活性。AKT無疑是PI3K下游信號傳導通路中的核心，介導了PI3K引起的許多生物反應。PI3K、AKT能夠磷酸化并調控許多跟細胞代謝、凋亡、增殖和分化有關的蛋白，進而可通過多種途徑調節細胞存活，抵抗細胞凋亡。

研究發現，PI3K/AKT途徑在許多人類腫瘤中都是上調的，一些因素引起的腫瘤細胞增殖與該信號通路密切相關[13]。在胰腺癌中伴隨著AKT活化，Shi等[14]應用PI3K抑制劑LY294002顯示可以明顯抑制胰腺癌細胞的生長。Li等[15]發現LY294002還可以導致胰腺癌細胞的凋亡。通過轉染突變性的AKT(無ATP結合位點)，證明了胰腺癌增殖明顯減慢和促進凋亡的形成。以上研究表明PI3K/AKT信號通路在胰腺癌發揮著重要的作用。

ARHI可以抑制細胞的增殖和促進細胞的凋亡，與Ras家族上述信號轉導途徑作用相反，發揮著負向調節細胞生長作用。本研究觀察了ARHI是否通過與Ras共同PI3K/AKT信號通路負向調節細胞的生長，結果顯示目的基因組與空載體組相比，p-AKT的表達明顯降低，總AKT沒有變化，而ARHI組在EGF刺激0、15、30、60 min時，p-AKT沒有明顯的區別。因此ARHI作為抑癌基因抑制細胞的生長、誘導細胞凋亡，可能與PI3K/AKT信號通路有一定的關系，這為我們進一步研究打下了基礎。

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(本文編輯：趙麗潔)

Tumor suppression of ARHI gene on pancreatic cancer cell and mechanism

LU Xin-qing,ZHANG Wen-xian,LI Xiao-tian，ZHAI Jian-wen,SHEN Xiang-rong,LIU Zhi-jun*

(Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan 056002，China )

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of aplysia ras homolog I(ARHI) gene on pancreatic cancer cell (PANC-1 and MiaPaCa-2)proliferation and to study the inhibition mechanism on the cancer cell growth.MethodsPANC-1 and MiaPaCa-2 cell lines were transfected with the ARHI constructs or with an empty plasmid as a control using lipofectmine 2000,and ARHI or vector stable transfected cell line was established by G418 selection.ARHI protein expression was analyzed by western blot method respectively.The growth curve was used to determine the effect of ARHI on the proliferation of stable transfected cell line.Western blot was used to examine the expression of protein T-AKT,p-AKT.ResultsThe ARHI stable transfected pancreatic cancer cells produced obvious expression of ARHI protein,but failed to induce detectable ARHI expression in empty plasmid transfected cells.The stable transfected pancreatic cancer cells all revealed a trend of increase with time prolonged in the non-transfected group,the empty plasmid transfected group and ARHI group,but pancreatic cancer cells grew most slowly in ARHI group.Statistical difference existed among these groups(P<0.05 or <0.01).The level of phosphorylated AKT in ARHI transfectants was found down-regulated when compared with vector controls in the regulation of PI3K/AKT signaling pathway.ConclusionARHI inhibited the growth of pancreatic cancer cell.ARHI expression blocked the activation of PI3K/AKT signaling in pancreatic cancer cells and may play an important role in the pancreatic carcinogenesis.

[Key words]pancreatic neoplasms;gene expression;cell proliferation

[中圖分類號]R735.9

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)12-1375-05

[作者簡介]路新卿(1975-)，男，河北邯鄲人，河北工程大學附*通訊作者。E-mail：gdyylzj@163.com

[基金項目]河北省科學技術研究與發展計劃(13277744D；14277735D)；河北省高等學?？茖W技術研究項目(ZD20131002)；河北省醫學科學研究重點課題(20110156)

[收稿日期]2015-10-21；[修回日期]2015-11-23

屬醫院副主任醫師，醫學博士，從事消化內科疾病診治研究。