胸腔積液酶聯免疫斑點檢測對結核性胸膜炎的診斷價值

崔　丹，趙　杰，馮秀莉，李志惠(河北省胸科醫院結核一科，河北 石家莊 050041)

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·論著·

胸腔積液酶聯免疫斑點檢測對結核性胸膜炎的診斷價值

崔丹，趙杰，馮秀莉，李志惠*(河北省胸科醫院結核一科，河北 石家莊 050041)

[摘要]目的探討胸腔積液酶聯免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)診斷結核性胸膜炎的臨床價值。方法將收治的胸腔積液患者163例分為結核性胸膜炎組(結核組)103例和非結核性胸膜炎組(對照組)60例。對所有胸腔積液患者進行ELISPOT、腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測。結果結核性胸腔積液中ELISPOT及ADA水平顯著高于非結核性胸腔積液(P<0.01)。ELISPOT診斷結核性胸膜炎的敏感度(92.2%)，高于ADA的敏感度(81.6%)。ELISPOT診斷結核性胸膜炎的特異度(93.3%)，與ADA的特異度(91.7%)差異無統計學意義(P>0.05)。結論ELISPOT診斷結核性胸膜炎敏感度高，同時具有很好的特異度，可作為診斷結核性胸膜炎的重要參考指標。

[關鍵詞]結核，胸膜；胸腔積液；酶聯免疫斑點測定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.005

結核性胸膜炎是胸膜由結核分枝桿菌侵犯及機體對結核蛋白成分過敏狀態的胸膜炎癥，是臨床常見的肺外結核病。傳統診斷結核性胸膜炎的方法如結核菌培養及胸水抗酸染色陽性率極低，胸腔積液腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測是目前診斷結核性胸膜炎常用的且較為準確的指標之一，但其敏感度較低；故目前結核性胸膜炎的診斷依然還需要通過病史、影像學和療效觀察等一系列臨床表現，尚缺乏敏感度及特異度較高的指標。酶聯免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是通過檢測外周血及體液中結核特異性釋放γ干擾素水平(interferon-γ,IFN-γ)來檢測結核感染的方法，因其敏感度及特異度高[1]，在發達國家廣泛應用。由于結核感染具有隔室化效應[2]，即抗原特異性T細胞向病變部位集中，故結核性胸膜炎胸腔積液的ELISPOT有可能較外周血具有更高的診斷價值[3-4]。本研究通過ELISPOT方法檢測103例結核性及60例非結核性胸腔積液的IFN-γ水平，探討胸腔積液ELISPOT對結核性胸膜炎的診斷意義。現報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2011年12月—2013年12月我科收治的胸腔積液患者(剔除診斷不明確及無病理、細菌學相關證據臨床診斷的結核性胸膜炎)163例。結核性胸膜炎患者(結核組)103例，男性53例，女性50例，年齡19～69歲，平均(45±16)歲；其中胸腔積液抗酸染色陽性43例，羅氏培養結果陽性36例，胸膜組織活檢病理明確診斷24例。非結核性胸膜炎患者(對照組)60例，男性34例，女性26例，年齡21～69歲，平均(51±17)歲；其中腫瘤性胸腔積液47例，原發胸膜惡性病變7例，肺炎旁積液6例。腫瘤病理均經過病理細胞學證實，其他疾病經常規檢驗、影像學及療效等證實。所有入選病例均無均艾滋病，病毒抗體陰性，無合并糖尿病及風濕免疫系統疾病，無嚴重心、肝、腎功能不全。

1.2方法

1.2.1ELISPOT采用英國Oxford Immunotec公司生產的T-Spot-TB試劑盒，于治療前取新鮮胸腔積液100 mL立即進行檢測(樣本采集后2 h內送實驗室，4 h內完成檢測)。胸腔積液分離得到胸水單個核細胞并制備成濃度為2.0×106/mL的細胞懸液。細胞培養液作為陰性對照，植物血凝素(phytohae magglutinin,PHA)作為陽性對照，結核菌特異性抗原早期分泌抗原靶6(early secretory antigen 6，ESAT-6)和培養濾液蛋白10(culture fitrate protein,CFP-10)作為刺激抗原。每孔加入含2.5×105個細胞的細胞懸液，將微孔板放在含5%二氧化碳的培養箱中培養18～20 h，第2天洗板后加入生物素標記的二抗，2～8 ℃反應1 h，洗板后加入顯色底物液，室溫靜置7 min，去離子水終止反應。通過細胞毒性T細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)酶聯免疫斑點系統記錄斑點數。結果判定標準：當空白對照孔內斑點數<6時任一實驗孔斑點數減去空白孔斑點數≥6，結果即為陽性；若空白對照孔斑點數≥6，任一實驗孔斑點數≥2倍空白孔斑點數結果即為陽性。否則為陰性。

1.2.2ADA檢測取新鮮胸腔積液10 mL，以1 000 r/min離心5 min，取上清液用酶法測定ADA活性，參照試劑盒說明進行診斷，ADA≥45 U/L定義為陽性。

1.3統計學方法應用SPSS 18.0統計軟件分析數據，計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1ELISPOT和ADA檢測陽性率比較結核組胸腔積液中ELISPOT和ADA檢測水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1　2組胸腔積液ELISPOT和ADA檢測水平比較

2.2ELISPOT和ADA檢測的敏感度和特異度ELISPOT的敏感度92.2%(95/103)、特異度93.3%(56/60)，高于ADA檢測的敏感度81.6%(84/103)、特異度91.7%(55/60)。

2.3ROC曲線分析胸腔積液ADA 活性和ELISPOT的ROC曲線下面積分別為0.913(95%CI為0.891～0.970)和0.901(95%CI為0.832～0.960)。ADA的最優截斷點為42.581 U/L；胸腔積液ELISPOT的SFC數≥176/106胸水單個核細胞為診斷界值，可獲得相對較高的診斷敏感度及特異度。

3討論

胸腔積液的鑒別一直是臨床診斷的一個難點，其中結核性胸膜炎占胸膜疾病的49.6%，且發病呈逐年上升趨勢[5]。結核性胸膜炎的診斷金標準是胸水中找到或培養出結核分枝桿菌，但因陽性率低[6]；胸膜活檢雖然特異度較高，但其創傷較大限制了其廣泛應用。由于現有方法診斷結核性胸膜炎的局限性，迫切需要一種快速、敏感的診斷技術來提高結核性胸膜炎的診斷效率。

ELISPOT是檢測細胞免疫功能的方法，已廣泛應用到結核分枝桿菌感染的快速診斷中[7]。當機體感染結核后產生致敏淋巴細胞，經外源性特異抗原刺激后可產生效應T細胞。T-Spot-TB是利用結核特異抗原ESAT-6、CFP-10，通過ELISPOT檢測受試者體內是否存在結核效應T淋巴細胞，從而判斷目前是否感染結核桿菌的新方法。

目前外周血單個核細胞結核菌特異性IFN-γ的ELISPOT已廣泛應用于結核感染的診斷，但由于外周血ELISPOT不能區分潛伏和活動性結核病，導致診斷特異度受限[8]。結核感染局部有隔室化效應，直接來源于胸膜腔的胸液局部細胞數量顯著高于外周血。有文獻報道結核性胸膜炎患者胸腔中效應T細胞數量較外周血高10～15倍[9]。Wilkinson等[10]研究證實胸腔積液的ELISPOT對結核性胸膜炎的診斷效能遠大于外周血。ADA是人體嘌呤核苷代謝中的一種酶,廣泛存在于全身各組織器官中，其中淋巴細胞特別是T 細胞內ADA的含量最高。有資料顯示結核性胸膜炎時胸腔積液中的ADA 含量明顯增高,主要與T 淋巴細胞受到抗原刺激后激活、增殖、分化明顯增多有關[11]。目前認為ADA是傳統診斷結核性胸膜炎的重要指標，在很多國家已成為診斷結核性胸膜炎的常規檢查項目。本研究結果顯示，結核組胸腔積液中ELISPOT和ADA檢測水平顯著高于對照組，差異有統計學意義；胸腔積液ADA 活性和ELISPOT的ROC曲線下面積分別為0.913(95%CI為0.891～0.970)和0.901(95%CI為0.832～0.960)，表明胸腔積液的ELISPOT和ADA檢測均可作為診斷結核性胸膜炎的參考指標，胸腔積液ELISPOT的SFC數≥176/106胸腔積液單個核細胞為診斷界值，可獲得相對較高的診斷敏感度及特異度。

本研究結果顯示，ADA檢測與ELISPOT診斷結核性胸膜炎的特異度相近(91.7%vs93.3%)，但ELISPOT在結核性胸膜炎早期診斷中具有較胸腔積液ADA檢測更高的敏感度(92.2%vs81.6%)。ELISPOT可作為診斷結核性胸膜炎的重要輔助診斷指標。如果ELISPOT與ADA檢測聯合則可進一步提高結核性胸膜炎的診斷效率。

由于本研究受到樣本量的限制，故其結論尚有待進一步證實。

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(本文編輯：劉斯靜)

Enzyme-linked immunospot assay in diagnosis of tuberculous pleurisy

CUI Dan,ZHAO Jie,FENG Xiu-li,LI Zhi-hui*

(Department of Tuberculosis,Hebei Chest Hospital,Shijiazhuang 050041,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the enzyme-linked immunospot assay(ELISPOT) in the diagnosis of tuberculous pleurisy.MethodsA total of 163 pleural effusion patients admitted to hospital were enrolled.The patients were divided into tuberculous pleurisy group and non tuberculous pleurisy group.The pleural effusion in all patients was detected by ELISPOT and adenosine deaminase(ADA) activity was tested.ResultsELISPOT and ADA activity were significantly higher in tuberculous pleural effusion than non tuberculous pleural effusion(P<0.01).The sensitivity for the tuberculous pleurisy diagnosis by ELISPOT 92.2%,was higher than ADA sensitivity,81.6%.The specificity for the tuberculous pleurisy diagnosis by ELISPOT 93.3%,showed no significant difference as compared with ADA specificity,91.7%.ConclusionELISPOT can be a useful tool in diagnosing tuberculous pleurisy and is specific.

[Key words]tuberculosis,pleural；pleural effusion；enzyme-linked immunospot assay

[中圖分類號]R521.7

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)12-1384-03

*通訊作者

[作者簡介]崔丹(1982-)，女，河北任丘人，河北省胸科醫院主治醫師，醫學碩士，從事結核性疾病診治研究。

[收稿日期]2015-04-15；[修回日期]2015-06-24