miR-199在對順鉑敏感性不同的卵巢癌細胞株中的表達及其意義

柳長青，徐漢杰，周穎，趙衛東

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院，合肥 230001；2.安徽省分子醫學重點實驗室；3.安徽省腫瘤醫院)

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·基礎研究·

miR-199在對順鉑敏感性不同的卵巢癌細胞株中的表達及其意義

柳長青1,3，徐漢杰1,2，周穎2，趙衛東1,3

(1.安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院，合肥 230001；2.安徽省分子醫學重點實驗室；3.安徽省腫瘤醫院)

[摘要]目的探討miR-199在卵巢癌細胞株中的表達，尋找卵巢癌化療敏感性的指標。方法組學分析找出在順鉑敏感性不同的卵巢癌細胞株， miR-199的表達量差異較為顯著，qRT-PCR和western blot方法檢測瞬時轉染miR199 mimic/antagomir后的卵巢癌細胞株,P63表達水平發生顯著變化。結果miR-199在對順鉑耐藥的ES-2細胞中表達水平高于在對順鉑耐藥的SKOV3細胞中的表達，miR-199的下游蛋白P63的表達也有差異。結論miR-199與P63在一定程度上可以預測卵巢癌順鉑化療敏感性， miR-199可能是通過其下游靶基因P63發揮其在卵巢癌順鉑化療敏感性中的作用。

[關鍵詞]卵巢腫瘤；抗藥性，腫瘤；順鉑；紫杉酚；氟尿嘧啶

人們通過對癌癥耐藥機制的深入研究，漸漸認識到卵巢癌的耐藥不僅與基因突變等遺傳學機制有關，也與表觀遺傳學異常密切相關[1-4]。近幾年來，DNA甲基化組學、mRNA組學以及蛋白組學的不斷研究發展，更為檢驗出與癌癥相關異常表達的因子提供了方便[3]。此次研究中，我們借助組學分析及qRT-PCR等技術手段分析miR-199在順鉑敏感度差異性較大的SKOV3和ES-2卵巢癌細胞系中的表達情況，為尋找預測卵巢癌化療敏感性指標及耐藥機制提供新的方向。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系ES-2(上海細胞庫：NO.C0585)COC1(北京腫瘤醫院細胞庫：NO.HB-5606)COC2(北京腫瘤醫院細胞庫：NO.HB-5607)，SKOV3和HO8910均來自安徽省立醫院分子生物學實驗室。

1.1.2化療藥物紫杉醇注射液(paclitaxel，北京雙鷺藥業股份有限公司)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,上海旭東海普藥業有限公司)，順鉑注射液(cisplatin，江蘇豪森藥業股份有限公司)，注射用奈達鉑(nedaplatin，江蘇奧康賽藥業股份有限公司)，多西他賽注射液(docetaxel，江蘇奧康賽藥業股份有限公司)，注射用絲裂霉素(mitomycin，浙江海正藥業股份有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養卵巢癌細胞系在含10%胎牛血清的雙抗(100 u/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)DMEM培養基中，于37℃、5%CO2恒溫箱內培養，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.2.2qRT-PCRTRIzol法提取細胞的總RNA，無RNA 酶的DNA 酶I處理RNA 中污染的DNA，樣品經過酚和氯仿抽提后，溶解于DEPC 處理的水中，提取的細胞總RNA 5 ug與1 μL 100mM Oligo(dT)，1 uL 10mM dNTPs混合，65 ℃加熱5 min后，立即冰上放置5 min。在冰上預冷RNase free反應管內加入以下試劑至總體積25 μL。混勻，離心后在室溫下反應1 h，接著85℃ 10 min 滅活處理。樣品儲存于-20 ℃。用SYBR?PCR分析儀對RNA水平進行檢測。P63引物信息如下表1。

表1　P63引物信息

1.2.3Western blot 細胞收蛋白，定量蛋白用SDS-polyacrylamide gel分離后，轉移到PVDF膜上。一抗(1:500)過夜，加二抗，1 h后HRP化學發光、顯影。GAPDH作為內參。Tanon 6200顯影拍照。顯影圖片用Smartview分析軟件進行密度分析掃描。

1.2.4核酸的瞬時轉染(Lipofectamine 2000)(1)轉染前1天，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為90%~95%。細胞鋪板在2 mL雙無DMEM培養基中。(2)對于每孔細胞，使用250 μL無血清的DMEM培養基稀釋4.0 μg DNA，輕輕混勻。(3)使用前將Lipofectamine 2000轉染試劑輕輕混勻，用250μL DMEM培養基稀釋10 μL Lipofectamine 2000轉染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine 2000稀釋后，在5 min內同稀釋的DNA混合。(4)混合稀釋的DNA(第2步)和稀釋的Lipofectamine 2000(第3步)。室溫放置20 min。棄液，無血清培養基清洗2次。(5)直接將復合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。在37 ℃，5%CO2中保溫4~6 h后，加入完全培養基繼續培養。

2結果

2.1IC50值的比較SKOV3和ES-2細胞對順鉑(DDP)敏感性差異最大(IC50比值=124.52，圖1)；其他幾種化療藥物的敏感性差別較小：IC50比值較低，分別為紫杉醇(4.25)，5-氟尿嘧啶(1.96)，奈達鉑(2.12)，絲裂霉素(2.44)和多西他賽(25.34)。IC50相對數值見表2。

表2　化療藥物在卵巢細胞的相對IC50值

2.2化療敏感性不同的卵巢癌細胞間的miR差異性表達miRNA表達譜的測序結果顯示miR-199在COC1、COC2和ES-2細胞表達高于SKOV-3中的表達：分別為955,377,1245和70，差異顯著(見圖2)。相反，我們另外設置一個作為對照的無關miRNA，即miR-127-3p，它在各個卵巢癌細胞系中的resds值很低，且無差異。

2.3miR-199在SKOV3和ES-2細胞系中的表達情況qRT-PCR檢測miR-199在ES-2、SKOV-3卵巢癌細胞系中的表達設miR-199在SKOV3相對表達水平為1.00，則ES-2的表達水平為5.27(P=0.024)，與miR表達譜的測序的結果一致(見圖2，圖3)。

2.4miR-199下游基因P63在SKOV3和 ES-2細胞系中的表達Western blot檢測結果顯示P63在SKOV3中的表達水平高于在ES-2細胞中(見圖4)。在SKOV3和ES-2卵巢癌細胞株中轉染miR-199-mimic/antagomir后檢測P63的mRNA及蛋白表達水平。

qRT-PCR結果顯示轉染miR-199 mimic的SKOV3細胞中，P63的mRNA水平是降低的(ABCC8不是miR-199的靶基因，作為第二內參)，轉染miR-199 antagomir的ES-2細胞，其mRNA表達水平升高(見圖5)。可以看出，人為地改變miR-199地水平對于P63地mRNA水平有影響，但是不能改變ABCC8的mRNA水平。

Western blot結果顯示轉染miR-199 mimic的SKOV3細胞中，P63的相對表達降低，轉染miR-199 antagomir的ES-2細胞，P63的表示水平則增高(見圖6)。結合上述結果，說明P63基因直接受到miR-199的調控，是miR-199的靶基因。

3討論

目前，臨床上缺乏有效預測卵巢癌對于化療藥物敏感性方法，使得盲目和過度化療在所難免。因此，考慮到能夠發現有效預測化療耐受性的分子標記是迫切需要解決的，基礎和轉化醫學的研究越來越備受關注。在分子水平上，國內外科研人員發現了許多可作用于卵巢癌發病機制的通路和基因[5]。其中，miRNA的眾多下游基因的表達調控與卵巢癌的發生發展以及耐藥性有一定關系[6]。

miRNAS是調節目的基因轉錄后的非編碼RNA，在廣泛的物種中狀態穩定，通常參與轉錄后的基因調控。miRNAS通過綁定特定的3′-UTR區來負調控基因的表達。由于miRNA不需要特異性的結合位點和識別短小片段來擴展5′-seed區域，一個miRNA可以調節數以百計個miRNAs，多個miRNAs同樣也可以共同調控一個miRNA[7]。miRNAs預計監管大約60%的人類基因，參與基因的調控作用，如發生發展、分化、代謝、增殖、細胞周期、炎癥和免疫系統調節[8]。目前，眾所周知miRNAs在癌癥中可以上調和下調。超表達的miRNAS可下調腫瘤抑制基因的表達，而表達下調的miRNAS可作為腫瘤抑制因子負調節致癌基因[9]。Let-7家族在各種腫瘤中表達下調，從而作為腫瘤抑制因子出現[10]。miR-15和miR-16的靶基因BCL2是一種致癌基因，下調BCL2會導致白血病細胞的凋亡[11]。也有一些證據證明miR-199負調控其下游靶基因導致腫瘤細胞耐藥性的改變，但是其作用還有待于進一步研究[12]。以上研究結果只代表一小部分科研人員強調miRNAS在各種惡性腫瘤以及癌癥生物學中的作用。

為了闡述卵巢癌細胞耐藥的機制，我們對5種卵巢癌細胞系分別進行6種臨床常見化療藥物進行敏感性實驗分析。通過測得每種細胞的IC50值，我們發現SKOV3和ES-2兩株細胞系對順鉑的敏感性相對其他株細胞系，具有顯著的差異。我們猜想對同一種藥物有如此明顯差異的兩株細胞系，其內必有導致產生這種現象的非人為因素，具有進一步研究的價值。

由于miRNA的眾多下游基因的表達調控與卵巢癌的耐藥性有一定關系，且參與卵巢癌耐藥性的基因受到miRNA的調節，例如：miR-29轉錄后水平調節DMNT3B的表達[9]。因此，我們從該調控機制出發，研究卵巢癌細胞系對DDP耐藥性的機制，希望找出新的可以指導臨床的耐藥機制。我們分析比較了SKOV3和ES-2的miR表達譜式，篩選出幾十個表達差異明顯的miR，其中我們選擇了差異性最為明顯的miR-199來進行研究。

我們用Solexa二代深度測序技術繪制4種卵巢癌細胞系：COC1、COC2、SKOV3和ES-2的miR表達譜，在有差異性表達的數十個miR中，miR-199的表達水平與卵巢癌細胞系的順鉑化療敏感性相關性尤為緊密。接著我們通過qRT-PCR復測miR-199在順鉑敏感性差異較大的兩株卵巢癌細胞系的表達情況，其表達水平與miR表達譜的測序結果一致，miR-199的表達高低與卵巢癌的順鉑的敏感性密切相關。

眾多研究報道，P63的生物學功能在轉錄調控、細胞凋亡以及腫瘤發生發展中占據重要地位[8,13]，尤其是參與細胞凋亡方面，考慮到凋亡蛋白與化療藥物敏感性之間的關系，我們猜想P63的表達改變或許就是影響卵巢癌細胞順鉑敏感性的“鑰匙”。接著我們通過查閱大量文獻和相關網站搜索，發現P63在SKOV3和ES-2中的蛋白表達趨勢與理論預測相符合，猜想P63與miR-199具有一定的相關性。接著，我們瞬轉miR-199 mimic到SKOV3細胞中，P63的mRNA和蛋白表達水平均降低；而瞬轉miR-199 antagomir到ES-2細胞中，P63的mRNA和蛋白表達水平均上揚，進一步證實了猜想的準確性。至此，我們的研究基本確定了miR-199負調控其下游靶基因P63參與卵巢癌順鉑耐藥性的改變，但是除了P63基因外，也許還有其它miR基因參與調控，這些將是我們下一步需要考慮研究的方向。

(本文圖1~6見插圖3-1)

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The expression and significance of miR-199 in ovarian cancer cell lines

LiuChangqing*,XuHanjie,ZhouYing,ZhaoWeidong

(*AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

[Abstract]ObjectiveIn this study,we aimed to detect the expression of miR - 199 and searched for chemotherapy sensitivity of indicators in ovarian cancer cell lines and.Methods Omics analysis had found that in ovarian cancer cell lines which had different sensitivities to cisplatin,the difference of expression of miR - 199 is significant.Then used specificity methylation PCR and western blot to verify the expression level of P63 gene in ovarian cancer cell lines of the transient transfection miR199 mimic/antagomir.ResultsThe expression level of miR-199 in ES-2 is much higher than in the expression of SKOV3 cells.The expression of p63 is negatively correlated with the expression of miR-199.ConclusionsmiR-199 and P63 may predict the sensitivity to cisplatin chemotherapy to some extent.miR-199 may effect the sensitivity to cisplatin chemotherapy of ovarian cancer by regulating its downstream target genes P63.

[Key words]Ovarian neoplasms；Drug resistance，neoplasm；Cisplatin；Paclitaxel；Fluorouracil

(收稿日期:2015-04-22)

Corresponding author:Zhao Weidong,Email：victorzhao@163.com

通信作者：趙衛東，副教授，主任醫師，碩士生導師，Email:victorzhao@163.com

作者簡介：柳長青，碩士在讀，Email：aydlcq@126.com

基金項目：國家自然科學基金(81272881)；安徽省科技攻關計劃項目(08010302101)

中圖分類號：R737.31

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.021