上調miRNA145對肝癌細胞的作用及其機制研究*

王寰昱，王亞峰，張昆松，張朝暉，張梓健，黃陜州，吳　健，彭寶崗，陳　東△，周　奇△(中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州50080;河南省人民醫院肝膽外科，河南鄭州450000)

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上調miRNA145對肝癌細胞的作用及其機制研究*

王寰昱1▲，王亞峰2▲，張昆松1，張朝暉1，張梓健1，
黃陜州1，吳健1，彭寶崗1，陳東1△，周奇1△
(1中山大學附屬第一醫院肝膽外科，廣東廣州510080;2河南省人民醫院肝膽外科，河南鄭州450000)

［摘要］目的:探討微小RNA145 (miRNA145)對肝癌細胞生長、凋亡及侵襲轉移的影響。方法:實驗將HepG2細胞隨機設置為3組:空白對照組、空質粒組及轉染組，轉染后real-time PCR法檢測驗證各組細胞miRNA145及N-鈣黏蛋白(N-cadherin) mRNA的表達，并用Western blot檢測miRNA145目標蛋白N-鈣黏蛋白的表達，MTS增殖實驗檢測各組細胞的生長情況，流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡率，Transwell法檢測各組細胞的侵襲轉移能力。結果: Real-time PCR結果證實轉染組細胞miRNA145表達比空質粒組和空白對照組細胞明顯增多(P＜0.05)，同時N-鈣黏蛋白的表達在轉染組細胞中顯著減少(P＜0.05) ;經Western blot結果證實，轉染組細胞中N-鈣黏蛋白表達比空質粒組和空白對照組細胞明顯減少(P＜0.05) ;轉染組細胞活性在轉染后第2天、第3天均明顯下降，70.04%的細胞周期停止在G1期，轉染后HepG2細胞凋亡率明顯增高，細胞的侵襲轉移能力下降，差異均有統計學意義。結論:上調miRNA145表達能有效抑制肝癌細胞的細胞周期進展和侵襲轉移，促進細胞凋亡。

［關鍵詞］微小RNA145;肝細胞癌;細胞增殖;細胞凋亡;細胞侵襲

［修回日期］2015-05-04

▲并列第1作者

Role of up-regulated microRNA145 in viability，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma cells

WANG Huan-yu1，WANG Ya-feng2，ZHANG Kun-song1，ZHANG Chao-hui1，ZHANG Zijian1，HUANG Shan-zhou1，WU Jian1，PENG Bao-gang1，CHEN Dong1，ZHOU Qi1
(1Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China;2Department of Hepatobiliary Surgery，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450000，China.E-mail: hnzhouqi @163.com; gzbobsums@ gmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of microRNA145 (miRNA145) on the viability，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma HepG2 cells.METHODS: HepG2 cells were randomly allocated into 3 groups: blank control group，empty mimic transfected group and miRNA145 mimic transfected group.Under the induction of LipofectamineTM2000，the recombinant was transfected into HepG2 cells.After transfection，the expression level of miRNA145 was detected by real-time PCR.The protein level of N-cadherin and the mRNA expression levels of miRNA145 and N-cadherin were detected by Western blot and real-time PCR.The cell viability was detected by MTS assay.The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.Invasion and metastasis were detected by Transwell assay.RESULTS: Compared with negative control，miRNA145 expression was up-regulated significantly，while the expression of N-cadherin was down-regulated significantly.Meanwhile，the cell viability，cell cycle，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma HepG2 cells were all significantly inhibited (P＜0.05).CONCLUSION: miRNA145 dramatically inhibits viability，apoptosis，invasion and metastasis of hepatoma cells.

［KEY WORDS］MicroRNA145; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Apoptosis; Cell invasion

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是癌癥中致死率較高的一種，盡管在過去的幾十年中，肝癌的各治療手段取得了顯著的進步，但患者的5年生存率仍然較低［1］，這與HCC具有較高的增殖侵襲遷移能力有關。微小RNA (mircroRNA，miRNA)是近年來新發現的、廣泛存在于真核生物體內的一類保守的非編碼單鏈小分子RNA，長度約22個核苷酸，主要通過與靶mRNA的3’UTR完全或不完全堿基配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而調控靶基因的表達，調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化［2］。嚴斌等［3］研究發現，miRNA145在肝癌細胞及肝癌組織中的低表達，可能與HCC的發生發展密切相關。近年來隨著研究的不斷深入，miRNA145在多種惡性腫瘤中，如直腸癌、膀胱癌［4-6］等，通過對各目標蛋白的控制來調節腫瘤的生長、增殖、凋亡和侵襲能力。本實驗就miRNA145對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移的影響做初步探討。

材料和方法

1主要材料

人肝癌細胞株HepG2由中山大學附屬第一醫院外科實驗室提供。

細胞培養基DMEM和胎牛血清購自HyClone; miR145模擬物購自廣州銳博生物科技有限公司; LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑購于Invitrogen; Opti-MEM培養基購于Gibco;單溶液細胞增殖檢測試劑購于Promega;細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于KeyGEN; N-鈣黏蛋白(N-cadherin)兔抗人多克隆抗體購于CST; II抗用武漢博士德生物工程有限公司的過氧化物酶標記羊抗兔IgG。

2主要方法

2.1細胞培養和轉染HepG2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，1～2 d換液1次。取對數生長期細胞接種于6孔板，設置空白對照組(control)、空模擬物轉染組即陰性對照組(negative control-miRNA145，NC-miRNA145)和miRNA145模擬物(miRNA145-mimic)轉染組。基因轉染步驟按LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑盒說明書進行，轉染后24 h熒光顯微鏡下根據熒光蛋白的表達觀察轉染效率。

2.2 Real-time PCR檢測細胞miRNA145及N-鈣黏蛋白的表達轉染后36 h收集各組細胞，按TRIzol法提取細胞總RNA，用分光光度計和瓊脂糖凝膠檢測總RNA純度和完整性。總RNA用逆轉錄反應合成cDNA后，用SYBR Green qPCR Super Mix和SYBR Green microRNA Assay Kit檢測樣本中的miR NA145含量。采用的miRNA145正向引物為5’-AC ACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGAA-3’，反向引物為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’; N-cadherin的正向引物為5’-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3’，反向引物為5’-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3’;內參照U6的正向引物為5’- CTCGCTTCG GCAGCACA-3’，反向引物為5’-AACGCTTCA-CGAA TTTGCGT-3’。反應條件50℃2 min;95℃2 min;95 ℃15 s，60℃32 s，40循環。反應結束后得到各個標本和內參照U6的基本循環數(Ct值)。根據公式計算目的基因相對含量(RQ值)，即為RNA相對含量，實驗重復3次。

2.3 Western blot驗證N-鈣黏蛋白的表達各組細胞用PBS洗滌后低速離心后棄去上清，加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上充分裂解細胞30 min離心后，取上清到新的EP管中。用BCA蛋白定量試劑盒分別測定各組細胞提取的總蛋白濃度后行SDSPAGE，180 mA恒流轉移蛋白至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入I抗，4℃搖床孵育過夜，封閉液洗滌3次分別加入HRP標記II抗，室溫下溫育1 h，發光試劑作用后，暗室曝光，經顯影、定影處理后，以GAPDH作為內參照。用ImageJ軟件分析各蛋白區帶的灰度值，并用各組細胞所得的灰度值與GAPDH蛋白對應區帶的灰度值比較分析蛋白的表達量。

2.4 MTS實驗檢測細胞活力以每孔1×104個接種于96孔板，轉染后收集各組細胞，每組分為0、12、24、48和72 h 5個時點，每個時點設置3個復孔。細胞貼壁后，每孔加入10 μL MTS孵育4 h，酶標儀讀板，MTS檢測讀取490 nm波長處吸光度(A)值，檢測3組細胞不同時間存活情況，繪制細胞存活曲線。

2.5流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率轉染后收集各組細胞，制成單細胞懸液，PBS洗滌2次，70%的乙醇固定過夜。按試劑盒操作說明書指導加相應試劑，4℃避光放置30 min，流式細胞儀檢測各組細胞周期;同樣方法收集、洗滌細胞，無須乙醇固定，按操作說明采用Annexin V/PI雙染，避光放置10 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

2.6 Transwell法檢測細胞的侵襲轉移能力轉染后收集各組細胞，無血清DMEM培養基制成單細胞懸液(1×105)加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培養基。37℃、5% CO2孵育24、48 h分別取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min，檢測細胞是否穿過小孔，若細胞穿過，則立即終止所有實驗組，拍照并統計。同樣方法收集單細胞懸液，加入到預先用Matrigel凝固過的Transwell小室中，37℃、5% CO2孵育48 h后取出小室，多聚甲醛固定染色，拍照統計。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗及單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1熒光顯微鏡下觀察轉染率

miRNA145-mimic組、NC-miRNA145組經轉染24 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀測各組細胞熒光表達，轉染效率均在70%以上，而control組未見熒光表達，見圖1。

Figure 1.Observation of transfection efficiency under the fluorescence microscope (×200).圖1熒光顯微鏡下觀察轉染效率

2 Real-time PCR轉染后miRNA145的表達情況

分別提取miRNA145-mimic、NC-miRNA145和control組的HepG2細胞的總RNA，檢測總RNA純度和完整性，可見5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA的條帶明亮、清晰、邊緣銳利，且28S的亮度大約是18S的2倍以上，說明所提取的總RNA有較好的完整性，見圖2。對RNA樣品進行紫外分光光度分析(A260/A280=1.9)，表明RNA具有較高的純度。后通過逆轉錄得到相應cDNA，以其作為模板對miRNA145和N-鈣黏蛋白進行擴增，在mRNA水平分別檢測各組miRNA145和N-鈣黏蛋白表達情況的差異。結果發現，轉染miRNA145模擬物的HepG2細胞的miRNA145表達比轉染NC-miRNA145和未轉染的HepG2細胞明顯增多，差異有統計學意義(P＜0.05)。N-鈣黏蛋白基因在轉染miRNA145模擬物的HepG2細胞的表達比轉染NC-miRNA145和未轉染的HepG2細胞明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

3 Western blot法驗證轉染后N-鈣黏蛋白的表達情況

分別提取3組HepG2細胞的總蛋白，用Western blot比較3組miRNA145蛋白表達水平的差異，結果顯示，轉染miRNA145模擬物的HepG2細胞，其N-鈣黏蛋白表達水平比轉染空模擬物組和未轉染組的HepG2細胞明顯減少(P＜0.05)，結果與PCR結果一致，見圖4。

4轉染miRNA145對肝癌細胞活力的抑制作用

細胞在490 nm處吸光度越高，表明其細胞活性越高。如表1所示，在第2、3天時轉染組A值顯著低于對照組(P＜0.05)。通過MTS實驗，將各組A值的均值繪制成曲線，反映各個時點細胞的活性情況，發現在第2、3天時，轉染組細胞活性顯著低于空白對照組和空載體轉染組(P＜0.05)，見圖5。

Figure 2.Result of the total RNA electrophoresis.圖2各組細胞的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 3.Real-time PCR analysis of miRNA145 and N-cadherin expression 36 h after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 Real-time PCR定量分析miRNA145及N-cadherin在各組細胞中的表達

Figure 4.Western blot analysis of N-cadherin expression 36 h after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖4 Western blot分析各組N-鈣黏蛋白的表達情況

5轉染后各組細胞的細胞周期及凋亡率的變化

空白對照組、空載體轉染組和miRNA145質粒轉染組G1期峰細胞比例分別為64.75%、65.93%和 70.04%，miRNA145質粒轉染組G1期的細胞數目明顯增加(P＜0.05)，見圖6;3組細胞的總凋亡率分別為3.22%、3.31%和4.78%，miRNA145質粒轉染組與空白對照組和空載體轉染組相比較細胞凋亡率增加(P＜0.05)，見圖7。

Figure 5.The effect of miRNA145 on the viability of hepatoma cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖5 MTS實驗分析miRNA145對人肝癌細胞活力的影響

表1　 miRNA145對肝癌細胞不同時點細胞活力的作用Table 1.The effect of miRNA145 on the viability of hepatoma cells at different time points (Mean±SD.n=3)

6轉染后細胞的侵襲轉移能力

Transwell體外遷移實驗結果，顯微鏡下計下室細胞個數并拍照，每種細胞每次隨機選取10個視野計數后取平均值繪制條形圖，轉染miRNA145的HepG2穿膜細胞數較轉染空模擬物的HepG2穿膜細胞數明顯減少(P＜0.05)，見圖8。

Transwell體外侵襲實驗結果，顯微鏡下計穿出細胞個數并拍照，每種細胞每次隨機選取10個視野計數后取平均值繪制條形圖，轉染miRNA145的HepG2穿膜細胞數較轉染空模擬物的HepG2穿膜細胞數明顯減少(P＜0.05)，見圖9。

討論

Figure 6.The cell cycle of the HepG2 cells in each group after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖6流式細胞儀檢測轉染后3組細胞的G1期峰細胞比例情況

Figure 7.The apoptotic rate of the HepG2 cells in each group after transfection.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖7流式細胞術檢測轉染后各組細胞凋亡率的變化

HCC惡性程度高，預后差，即使采用手術聯合化療的治療方案，治療效果仍不佳，術后HCC高復發率和轉移是影響患者治療效果和預后的關鍵因素，迫切需要尋求新的有效的治療靶點。miRNA具有廣泛的基因調節功能，能對基因活動的各個環節進行調節，參與一系列的生物學進程如胚胎的發育、細胞增殖、細胞凋亡和能量代謝等［7］。已有學者證實miRNA在肝癌的發生、發展過程中發揮癌基因或抑癌基因樣的作用(如miRNA-181b)［8］;另肝癌的生物學行為和一些miRNA家族成員(如miRNA-155、miRNA-101)有密切的關系［9］。

Figure 8.The results of Transwell metastatic test showed the metastatic ability of HepG2 cells (×200).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖8 Transwell體外遷移實驗

Figure 9.The results of Transwell invasion test showed the invasive ability of HepG2 cells (×200).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖9 Transwell侵襲實驗結果

miRNA145是近年來新發現的一類具有腫瘤抑制作用的microRNA，可在多種組織中廣泛表達。2003年Michael等［10］首先在人結腸腫瘤中發現miRNA145低表達，認為其可能與腫瘤發生密切相關。miRNA145定位于5號染色體(5q32-33)，其附近的5q31是一個非常重要的脆性位點。脆性位點通常在體細胞中穩定，但在許多腫瘤細胞中經常發生缺失或重排。位于脆性位點附近的miRNA145已被證實在多種腫瘤組織中低表達。研究發現在膀胱癌及直腸癌中，miRNA145目標作用于N-鈣黏蛋白、波形蛋白(vimentin)等可抑制惡性腫瘤細胞的上皮間質轉化［6，11］。Sachdeva等［12］研究發現miRNA145除具有腫瘤生長抑制作用外，而且對腫瘤細胞的侵襲轉移能力有明顯的抑制作用。目前越來越多研究結果顯示miRNA145具有調控多個靶基因，尤其是N-cadherin、vimentin等腫瘤細胞上皮間質轉化基因，可以通過調節這些靶基因從而影響細胞的間質轉化，抑制其侵襲轉移［11］。

嚴斌等［3］研究發現通過對臨床標本的檢測發現miRNA145在肝癌中的表達顯著低于正常組織及癌周組織，這與Varnholt等［13］的研究結果一致，提示該小分子RNA在肝細胞癌的發生發展過程中起著負調控的作用。

為了探索miRNA145在肝細胞癌中的作用機制，在本研究中，我們通過轉染技術在HepG2細胞中高表達miRNA145，首次發現在肝細胞癌中miRNA145作用于N-cadherin基因，并通過real-time PCR 及Western blot驗證其發揮抑制N-cadherin表達作用。隨后在Transwell侵襲轉移實驗中，我們發現轉染組細胞的侵襲遷移能力明顯減弱，穿膜細胞下降。這些結果提示miRNA145可以通過改變腫瘤細胞表面的黏附分子表達(如調控上皮間質轉化過程)而抑制肝癌細胞的遷移侵襲。于此同時，在MTS實驗中，我們發現轉染組的存活細胞顯著少于空白對照組，隨后通過流式細胞儀對各組細胞的周期和凋亡率進行分析，發現miRNA145表達增高可以使細胞周期停止在G1期;且轉染組細胞的凋亡數目及凋亡率均顯著增高。由此，我們認為miRNA145能夠抑制肝細胞癌的細胞周期進展、遷移侵襲，最終導致腫瘤細胞凋亡的增加。那么miRNA145可以靶向作用于N-cadherin，是否也能作用于其它黏附分子基因呢? miRNA145是通過什么具體作用機制抑制肝細胞癌的周期進展呢?這些都尚待進一步的研究。目前對肝癌仍采取以手術切除為主的治療方法，而術后出現復發和轉移是患者治療失敗和死亡的主要原因。miRNA介導腫瘤分子治療將可能成為根治腫瘤的重要發展方向。鑒于miRNA145在腫瘤中的抑癌基因作用，可通過上調miRNA145表達，抑制腫瘤細胞上皮間質轉化的能力，從而減少腫瘤耐藥，實現抑制腫瘤生長和侵襲轉移的治療目的。但這個設想離臨床應用尚遠，仍需進一步探索肝癌中miRNA145的生物學意義，miRNA145與靶基因相互作用機制miRNA安全性問題的研究。

綜上所述，上調miRNA145能明顯降低人肝癌細胞的生長、侵襲轉移能力，促進細胞凋亡。隨著人們對靶向治療肝細胞癌的需求不斷提高，miRNA145調控肝細胞癌的臨床價值令人充滿期待。

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通訊作者△Tel: 020-87755766;周奇E-mail: hnzhouqi@163.com;陳東E-mail: gzbobsums@ gmail.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81402504) ;廣東省科技計劃(No.2012B061700090) ;廣州市科技計劃(No.201300000187) ;大亞灣科技計劃(No.2013A01016; No.2014A01012)

［收稿日期］2015-03-30

［文章編號］1000-4718(2015)06-1019-07

［中圖分類號］R730.23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.010