間充質干細胞修復肝損傷的機制及膜微粒的生物治療潛力*

阮承蘭　綜述，陳從新　審校

間充質干細胞修復肝損傷的機制及膜微粒的生物治療潛力*

阮承蘭綜述，陳從新審校

【摘要】間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）移植是治療肝硬化和肝衰竭的重要方式。MSCs修復肝損傷的機制主要有三種：干細胞分化為肝細胞樣細胞，旁分泌作用和免疫調節功能及膜微粒（microvesicles，MVs）介導的信號傳遞。目前的研究表明，MVs介導的RNAs傳遞在組織修復中發揮著至關重要的作用，MVs移植可能成為修復肝損傷的一種新方式。本文重點介紹了移植入肝臟的MSCs可能的作用機制和MVs的生物治療潛力。

【關鍵詞】肝損傷；間充質干細胞；膜微粒；治療

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的一類多能干細胞，具有強大的自我更新能力和多向分化潛能［1］。分布于骨髓、臍帶（血）、肌肉、脂肪、肝臟、皮膚等多種組織器官的干細胞可被誘導分化為肝細胞、心肌細胞、神經細胞、脂肪細胞和胰島樣細胞等，已用于多種臨床疾病的治療，以修復受損的組織器官。MSCs移植已成為治療肝硬化和肝衰竭的重要方法。研究表明，MSCs移植可促進肝臟再生，并在一定程度上緩解患者的不適癥狀，改善肝功能和患者的短期預后［2，3］。進一步研究顯示，MSCs在凋亡的過程中可釋放膜微粒（microvesicles，MVs），后者介導的信號傳遞在組織修復中發揮極為關鍵的作用［4］。本文主要探討MSCs修復肝損傷的機制和MVs的生物治療潛力。

1　移植入肝臟的MSCs可能的作用機制

1.1干細胞分化為肝細胞樣細胞移植入體內的MSCs隨血流進入肝臟，穿過血管內皮間隙后進入肝組織，干細胞在局部肝損傷微環境所提供的細胞外信號的刺激下發生表型和功能的變化而分化為肝細胞樣細胞。在體外，用含有肝細胞生長因子和成纖維細胞生長因子-4的誘導培養基對培養的人臍血MSCs進行誘導分化，對誘導后細胞AFP、CK18、白蛋白、抗肝細胞抗體等幼稚和成熟肝細胞標志的檢測發現，誘導后的細胞具有肝系細胞的表型和功能［5］。Avital et al［6］用免疫磁珠法分選出人和大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs），通過門靜脈植入膽汁淤積大鼠肝內，電鏡下發現植入細胞具有與成熟肝細胞類似的超微結構，能表達ALB、AFP和CK-18等肝細胞特異性標志物，并且能合成尿素。陳建鋒等［7］將人骨髓干細胞經門靜脈移植入肝損傷大鼠肝臟內，于移植后14天和28天對大鼠的肝功能和肝臟組織學進行檢測發現，移植組大鼠肝功能得到顯著改善，人源性細胞在肝損傷大鼠肝臟中的替代率約為 10%，提示骨髓干細胞可在異體內分化為有功能的肝細胞樣細胞。MSCs可在體內外特定微環境下分化為具有類似肝細胞形態和功能的肝細胞樣細胞已得到上述研究的證實。1.2旁分泌作用和免疫調節功能MSCs除具有強大的增殖能力和多向分化潛能外，還兼有低免疫原性和免疫調節作用。其表面低表達人類MHCⅠ類分子，不表達人類MHCⅡ類分子及共刺激分子CD40、CD80和CD95等。因此，MSCs在體外不僅不能誘發免疫應答，反而具有抑制免疫反應的作用［8］。在體外將小鼠BMSCs與激活的鼠脾細胞或人臍帶MSCs與激活的人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）共培養，結果表明MSCs可強烈抑制激活的脾細胞和PBMC增殖，且這種抑制呈劑量依賴性［9］。Di et al［10］研究發現，MSCs是通過分泌肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）來抑制自體或異體T淋巴細胞增生。此外，MSCs還能抑制單核細胞分化為樹突狀細胞［11］。

多項研究發現，定植于肝臟的BMSCs通過旁分泌的形式分泌多種細胞因子和生長因子，如IL-10、HGF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和神經生長因子（nerve growth factor，NGF）等，這些旁分泌物質在促進肝臟再生和修復的同時，能抑制肝臟炎癥反應，改善凋亡誘導的肝損傷，提高血清白蛋白水平，促進細胞外基質的降解等［12～14］。

1.3MVs介導的信號傳遞幾乎所有的真核細胞，包括干細胞及其前體細胞，在凋亡的過程中，均會通過質膜出芽的形式產生囊泡狀MVs［15］。MVs為一種細胞亞結構，呈球形，具有細胞骨架和磷脂雙層結構，但不具有細胞核和蛋白合成能力，其表面表達了大量的生物活性物質、粘附分子、錨定受體和細胞表面特異性抗原等［16］，膜內含有多種細胞因子、趨化因子、生長因子、酶類及信號蛋白，某些細胞來源的MVs還含有功能性的RNA以及微小RNA等［17，18］。MVs可以通過與受體細胞膜融合直接釋放內含物（細胞因子、趨化因子、生長因子、酶類、信號蛋白和RNA等）的方式，或被受體細胞內吞，或通過膜表面分子與相應受體結合的方式激活目標細胞，使目標細胞的表型和功能發生改變［16，19］。

Camussi et al［20］發現，在組織修復過程中，MSCs與受損組織通過MVs相互傳遞基因產物，損傷組織將基因產物轉移給干細胞后，干細胞的表型可重新編碼，以獲得損傷組織的特征；另一方面，MSCs來源的MVs所攜帶的基因產物可誘導在損傷中幸存的細胞重新進入細胞周期，以促進組織修復。當用RNA酶預處理人肝臟干細胞來源的MVs后發現，MVs所具有的促進肝細胞增值和抑制肝細胞凋亡的效應幾乎完全消失，表明MVs介導的RNA轉移是其發揮生物學作用的重要機制［21］。另有研究用相似的方法證實了RNA傳遞是MVs促進血管再生和發揮組織修復作用的分子機制［22，23］。Herrera et al［21］研究發現，來源于人肝臟干細胞的MVs可在體外誘導人和大鼠肝細胞的增殖并抑制其凋亡；在對大鼠進行肝臟大部分切除術的同時，將MVs經靜脈注射到大鼠體內，在術后24 h、48 h和72 h均可檢測到MVs移植組大鼠肝細胞增殖顯著強于未進行MVs移植的對照組，且肝細胞的腫脹和脂肪變性顯著低于對照組。

1.4MSCs作用機制探討MSCs修復肝損傷的機制主要有上述三種，具體哪種機制在組織修復中發揮主要作用目前尚無一致意見，但明確干細胞的作用機制對生物治療方式的選擇與優化具有重要意義。

MSCs進入肝損傷微環境后可分化為肝細胞樣細胞，但這些分化而來的細胞不僅數量少，而且并不具備成熟肝細胞的全部表型和功能［24］。移植入體內的少量MSCs不可能在短期內分化為功能性的肝細胞而發揮顯著的抗損傷及組織修復作用。顯然，MSCs分化為肝細胞樣細胞不是MSCs發揮組織修復作用的主要方式。MSCs與受損肝細胞可通過MVs相互傳遞基因產物，在這一過程中，MSCs的表型可以重新編碼，以獲得損傷組織的特征［20］。據此推測，干細胞分化為肝細胞樣細胞可能是MVs生物學作用的一種表現形式。Bi et al［25］研究發現，將人骨髓基質細胞經靜脈或腹腔注射到順鉑誘導的急性腎衰竭小鼠體內，可顯著減輕腎損傷。在注射后1～4天，對小鼠腎臟組織切片進行觀察可見，腎小管內并無人骨髓基質細胞定植，僅在腎間質內觀察到極少量的移植細胞。注射骨髓基質細胞的培養基，可以獲得與細胞移植類似的效果，表明細胞移植不是必要的。

目前，已有多項研究證實，MSCs可以旁分泌多種細胞因子，且MSCs在凋亡的過程中釋放MVs，這些細胞因子和MVs都可能對損傷組織的修復產生積極作用。Parekkadan et al［26］用D-氨基半乳糖誘導大鼠暴發性肝衰竭后24 h靜脈注射BMSCs無明顯療效，而注射等量MSCs的溶解物則可改善大鼠的生存率；進一步研究發現，靜脈注射MSCs條件培養基（conditioned medium，CM）可明顯減輕損傷肝組織的白細胞浸潤、肝細胞變性壞死和凋亡。

那么，在MSCs的溶解物和CM中，能發揮肝臟修復作用的有效成分究竟是旁分泌物質、MVs，還是其它成分，則無從得知。MVs和可溶性旁分泌物質在分子量、體積方面存在較大差異。因此，一些學者通過超速離心或過濾的方式將MSCs-CM中的成分分離開來，以分別研究不同物質在組織修復中所扮演的角色及其作用機制。

在心血管疾病領域，Lai et al［27］對心肌缺血再灌注模型的研究發現，MSCs-CM能明顯減少心肌梗死的面積，而用濾過膜去除CM中分子量大于1000 KDa的物質后，其對心肌的保護作用幾乎消失。若將上述大分子物質進行靜脈輸注，則可發揮與CM類似的心肌保護作用。這一研究結果表明，MSCs-CM的心肌保護作用似乎不只是源于分子量通常為十幾個KDa的可溶性分子，MVs極有可能是MSCs發揮生物學效應的主要成分。MVs的發現和生物學作用的證實，豐富了MSCs組織修復作用旁分泌機制的內涵，MSCs旁分泌作用不再局限于細胞因子和趨化因子這些可溶性蛋白介導的信號傳遞。

在腎臟病領域，Reis et al［28］研究發現，在慶大霉素誘導的急性腎損傷大鼠模型中，靜脈注射BMSCs，MSCs-CM或從CM中提純的MVs均能抑制大鼠血清尿素氮和肌酐的升高，抑制腎實質細胞的壞死和凋亡并促進細胞增殖，可減少促炎性細胞因子并增加抗炎性細胞因子的水平，從而發揮腎臟保護作用。然而，當CM或MVs用RNA酶處理后，前述的腎臟保護作用顯著減弱。提示BMSCs的腎臟修復作用主要由MVs攜帶的RNAs所介導。

這些在心血管疾病和腎臟病領域的研究結果提示了MVs穿梭的RNAs可能是MSCs發揮組織修復作用的主要機制。這也為MVs應用于損傷組織的修復提供了實驗依據。

2　MVs的生物治療潛力

目前，MVs移植仍處于實驗研究階段。BMSCs來源的MVs可在體外刺激腎小管上皮細胞增殖，并抑制其凋亡［23，29］，在甘油誘導的嚴重聯合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠急性腎損傷模型中，MVs治療可加速腎臟形態和功能的恢復［23］。在這個實驗模型中，靜脈注射MVs可以取得與MSCs相似的治療效果，表明MVs可以介導，或者至少部分介導MSCs的組織修復功能。在順鉑誘導的致死性急性腎損傷模型中，單次注射MVs可改善SCID小鼠的生存率，而不能阻止慢性腎小管損傷；在損傷后不同時間多次注射MVs，不僅可進一步提高SCID小鼠的生存率，而且可以完全避免慢性腎小管損傷［29］。將PKH26標記的MVs經靜脈注射到腎臟缺血再灌注損傷大鼠體內，注射后2 h，在腎小球和腎小管腔中可檢測到MVs。在注射后6 h，部分腎小管上皮細胞中出現MVs。2天后該組大鼠血清肌酐、尿素氮水平和腎小管病變程度均顯著低于生理鹽水對照組［30］。

體內外實驗均表明，MVs可促進細胞的增殖并抑制細胞凋亡，可修復受損的組織細胞。現有研究結果顯示，靜脈注射MVs可改善急性肝損傷、心肌缺血再灌注損傷和急性腎損傷。這些研究成果也顯示了MVs在生物治療方面的潛力。

MVs制劑在生物治療方面有著獨特的優勢，并可能替代MSCs移植用于組織損傷的修復［19］。第一，來源于MSCs的MVs具有一定的穩定性，可長時間保存。體外反復超速離心或在-20℃多次凍融并不影響其形態大小，但將MVs在4℃和37℃條件下保存數天，其體積會明顯縮小［31］。將MVs在-20℃保存6個月并不影響其心肌保護作用和生物學活性［19］；第二，MVs體積小，易于穿過微血管到達靶器官，既能在較短時間內啟動組織修復，又可減少因微循環阻塞所致的組織損傷。Gholamrezanezhad et al［32］用111In-oxine標記MSCs后經肘靜脈注入失代償期肝硬化患者體內，示蹤結果顯示，干細胞首先積聚在肺組織，數小時后逐漸轉移至肝臟和脾臟，在數天后，肺組織和脾臟均有干細胞滯留。而將熒光標記的MVs經靜脈注射到腎臟缺血再灌注損傷大鼠體內6 h即可在肝臟中檢測到MVs，肺毛細血管中僅有很少量的MVs沉積［30］。因此，MVs可能更適于肝衰竭患者的治療；第三，因為有磷脂膜的包被，MVs中含有的多種生物活性成分不易被體液中的酶類降解，從而保證了膜內蛋白成分和核酸結構的完整性和生物學功能不被破壞［27，33］；第四，MVs表面存在眾多的粘附分子和錨定受體，與目標細胞上相應的配體及胞外基質有高度的親和性，可將有效的生物學成分快速轉運至特異組織及微環境［15，19］。除此之外，相對于MSCs移植，MVs制劑還能避免定植細胞可能的不良分化［34］和腫瘤的發生［35］。

MVs具有良好的組織修復特性，同時可以減少或避免細胞移植的副作用和并發癥，為肝硬化和肝衰竭的治療提供了新的選擇。但其作為一種新的生物制劑應用于臨床實踐還任重而道遠。如何獲得足夠數量和高純度的MVs，MVs的最佳治療劑量，經外周靜脈注射后能否定向歸巢，如何建立標準化的制備流程以獲取性質穩定的MVs，MSCs-MVs應用于臨床所涉及的倫理以及生物安全性等問題仍需要科研和臨床工作者的共同努力。

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（收稿：2014-04-16）

（本文編輯：張駿飛）

第一作者：阮承蘭，女，27歲，醫學碩士，醫師。E-mail：ruanchenglan@126.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.028

*基金項目：解放軍第105醫院院管課題［2013YG11］

作者單位：230601合肥市 安徽醫科大學第二附屬醫院肝病科（阮承蘭）；解放軍第105醫院感染病科（陳從新）

通訊作者：陳從新，E-mail：congxinc@aliyun.com

Application of mesenchymal stemcells and microvesicles in the treatment of patients with liver injuriesRuan Chenglan，ChenCongxin.DepartmentofInfectiousDiseases，105thHospital，AffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity，Hefei 230031，China

【Abstract】Transplantation of mesenchymal stem cells（MSCs）is an promising way in the treatment ofcirrhosis and liver failure.The possible mechanisms of MSCs in repair of liver injury are as follows：differentiation to hepatocyte-like cells，paracrine and immunomodulatory effects，and signal transmission mediated by microvesicles（MVs）.Results from present studies suggest that RNA carried by MVs has emerged as an important mechanism by which the stem cells may repair injured cells and MVs transplantation may become a new choice for improving decompensated liver functions.This review will discuss the possible mechanisms of intrahepatic transplanted MSCs and the potential of MVs in the treatment of liver injuries.

【Key words】Liver injury；Mesenchymal stem cells；Microvesicles；Treatment